农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化枣树增强抗性的研究

发布时间：2017-03-24 00:13

  本文关键词：农杆菌介导虎杖芪合酶基因遗传转化枣树增强抗性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：壶瓶枣(Zizyphus jujuba Mill.)是中国优质枣品种之一,但真菌性病害已严重制约了壶瓶枣生产；白藜芦醇作为植物次生代谢产物不但能提高果树抗真菌能力,还具有具有众多的药理和保健功能,其中最令人瞩目和具有发展前景的是其抗肿瘤、心血管保护、抗氧化功能。大量研究表明,遗传转化STS基因能够增强植物的抗真菌能力,本研究的目的为芪合酶基因遗传转化枣树提高枣树的抗真菌病害能力和改善枣的果品品质。壶瓶枣作为山西太谷的地理标识品种,经济价值高,产业发展前景好。白藜芦醇在虎杖根中含量较高,前期研究从虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.)根中分离得到白藜芦醇合成芪合酶关键基因PcPKS5(EU647245),具有高效催化合成白藜芦醇功能。本研究通过组织培养与遗传转化技术,对壶瓶枣优良单株进行组织培养,即获得高效茎尖和茎段诱导的丛生芽建立植物再生体系,构建虎杖芪合酶基因植物表达载体,转化农杆菌,将虎杖白藜芦醇生物合成关键基因PcPKS5遗传转化壶瓶枣。结果如下：(1)优化壶瓶枣径段诱导得到高分化率的丛生芽遗传转化体系。将壶瓶枣再生体系材料剪成0.8-1.0 cm含茎尖和茎段的外植体,农杆菌侵染菌液中浸泡15.0min,集中置于培养基上共培养3天,避光培养,转入含Cb300 mg/L, AS 60 mg/L丛生芽诱导分化培养基中培养5-6周。将分化丛生芽转接至含4.0mg/L Basta,5-6周检测阳性植株,为壶瓶枣成功实现遗传转化奠定了基础；(2)成功将狗头枣叶片外植体材料诱导出愈伤组织,并分化得到完整植株,并建立了狗头枣叶片再生遗传转化体系；(3)壶瓶枣遗传转化材料经Basta筛选、GUS显色、gDNA PCR、RT-PCR等检测证实,成功获得到3个阳性转基因壶瓶枣株系,荧光实时定量检测RNA瞬时表达得到其中株系2表达效率高于其他两个株系。经植物化学成分鉴定遗传转化植株中存在白藜芦醇,研究结果表明转化植株中虎杖芪合酶在壶瓶枣异源表达,目的基因表达代谢生成目标产物白藜芦醇,其鲜重含量为0.45μg/g,抑菌效果相当于1ug/ul白藜芦醇样品(抑菌率平均为23.08%),具备抗真菌桃褐腐(Monilinia fructicola)真菌、枣假尾孢(Isariopsis imdica var. Ziziphi)、细交链孢菌[Alternaria alternate(Fr.)Keissler]的能力。同时相对野生型植株,朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus)有趋避遗传转化植株的现象发生。本研究在壶瓶枣成功遗传转化虎杖芪合酶基因,获得壶瓶枣遗传转化新材料。且PcPKS5在枣树中异源表达,转基因材料中能够代谢合成白藜芦醇,提高转PcPKS5基因壶瓶枣抗枣树病原真菌病能力,研究结果为发掘枣树新的种质资源提供技术途径。有关壶瓶枣遗传转化材料是否在果实中积累,改善果品品质仍需深入研究。
【关键词】：遗传转化 虎杖芪合酶基因 枣树 农杆菌介导法 白藜芦醇 增强抗性
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S665.1
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-14
• 1. 绪论14-30
• 1.1. 枣栽培、产业发展及存在需要解决的问题14
• 1.2. STS基因与遗传转化代谢白藜芦醇14-19
• 1.2.1. STS基因15
• 1.2.2. 白藜芦醇是从植物体中获取最有前景的物质之一15-16
• 1.2.3. 白藜芦醇在营养和医药方面的应用16
• 1.2.4. 白藜芦醇在农业方面对应用16
• 1.2.5. 商业化生产白藜芦醇的方法16-19
• 1.3. 芪合酶遗传转化实例19-22
• 1.3.1. 芪合酶基因来源19
• 1.3.2. 农作物过表达芪合酶基因19-21
• 1.3.3. 果树基因工程研究现状21-22
• 1.3.4. 枣树基因工程遗传转化研究22
• 1.4. 立题依据与产业前景22-24
• 1.4.1. 立题依据22-24
• 1.4.2. 拟解决的关键问题24
• 1.5. 本研究的目的意义24-25
• 1.6. 技术路线25-26
• 1.7. 试验研究方法26-30
• 1.7.1. 枣树的高效率再生体系的研究26-27
• 1.7.2. 植物表达载体构建27
• 1.7.3. 遗传转化体系建立27
• 1.7.4. 遗传转化植株检测27-30
• 2. 芪合酶基因植物表达载体的构建30-36
• 2.1. 材料与方法30-31
• 2.1.1. 基因及试剂30
• 2.1.2. 方法30-31
• 2.2. 结果与分析31-34
• 2.2.1. 表达载体的构建与侵染菌株制备31-33
• 2.2.2. 构建植物表达载体的验证33-34
• 2.3. 讨论34
• 2.3.1. 表达载体构建成功34
• 2.3.2. 植物表达载体的应用前景分析34
• 2.4. 本章小结34-36
• 3. 壶瓶枣遗传转化体系的建立36-48
• 3.1. 材料与方法36-39
• 3.1.1. 壶瓶枣与试剂36-37
• 3.1.2. 方法37-39
• 3.2. 结果与分析39-45
• 3.2.1. 壶瓶枣枣苗生长状况结果的统计分析39-40
• 3.2.2. 壶瓶枣无性系生根40-41
• 3.2.3. 遗传转化影响因子的筛选41-43
• 3.2.4. 遗传转化体系的优化43-45
• 3.2.5. Basta筛选遗传转化体系材料的获得45
• 3.3. 讨论45-46
• 3.3.1. 外植体材料的可行性分析45
• 3.3.2. 壶瓶枣遗传转化体系的建立45-46
• 3.4. 本章小结46-48
• 4. 狗头枣遗传转化体系的建立48-58
• 4.1. 材料与方法48-51
• 4.1.1. 狗头枣及试验试剂48
• 4.1.2. 方法48-51
• 4.2. 结果与分析51-56
• 4.2.1. 狗头枣叶片诱导愈伤组织的培养基筛选51-52
• 4.2.2. 狗头枣愈伤组织的分化52-53
• 4.2.3. 狗头枣狗头枣诱导生根53
• 4.2.4. As对叶片愈伤组织诱导的影响53
• 4.2.5. 抗生素的筛选53-54
• 4.2.6. AgNO_3对愈伤组织分化的影响54
• 4.2.7. 无性系试管苗抗除草剂试验54-55
• 4.2.8. 狗头枣遗传转化体系优化55-56
• 4.3. 讨论56-57
• 4.3.1. 狗头枣叶片再生体系的建立56-57
• 4.3.2. 再生遗传转化体系仍需深入研究57
• 4.4. 本章小结57-58
• 5. 转基因材料测试验证58-68
• 5.1. 材料与方法59-61
• 5.1.1. 遗传转化材料及试剂59
• 5.1.2. 方法59-61
• 5.2. 结果与分析61-65
• 5.2.1. 阳性植株的检测61-63
• 5.2.2. 白藜芦醇的提取、分离与HPLC、LCMS分析63-65
• 5.3. 讨论65-66
• 5.4. 本章小结66-68
• 6. 转基因材料的抗性试验68-76
• 6.1. 材料与方法68-69
• 6.1.1. 遗传转化材料与枣病原真菌68-69
• 6.1.2. 方法69
• 6.2. 结果与分析69-73
• 6.2.1. 白藜芦醇抑菌桃褐腐试验69-70
• 6.2.2. 壶瓶枣遗传转化材料抑菌试验70-72
• 6.2.3. 遗传转化材料抗螨虫试验72-73
• 6.3. 讨论73-75
• 6.4. 本章小结75-76
• 7. 结论76-80
• 7.1. 主要结果76-77
• 7.1.1. 成功构建PcPKS5植物表达载体76
• 7.1.2. 建立和优化枣树再生遗传体系76
• 7.1.3. 虎杖芪合酶基因在枣树异源成功表达76
• 7.1.4. 转基因遗传枣树材料产生新的抗性76-77
• 7.2. 本研究的创新点77
• 7.3. 枣树转基因的展望与环境安全的思考77-80
• 参考文献80-94
• 附录94-96
• 个人简介96-98
• 导师简介98-100
• 成果目录100-102
• 致谢10

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