Viperin抑制狂犬病病毒机理的探索研究

发布时间：2017-03-23 22:05

  本文关键词：Viperin抑制狂犬病病毒机理的探索研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Viperin是一种干扰素诱导蛋白,可通过完全不同的机制对多种病毒发挥抗病毒活性。先前的研究没有viperin抑制狂犬病病毒(RABV)复制的报道。通常狂犬病病毒在其易感细胞中生长良好,具有较高的病毒滴度。最近我们的研究中发现,狂犬病病毒在巨噬细胞RAW264.7中生长缓慢,病毒滴度显著地低于易感细胞(如NA细胞)。进一步的研究发现,狂犬病病毒感染易感的NA细胞时,viperin表达微弱或不表达,但感染巨噬细胞时viperin被显著诱导表达。本研究为了探索抗病毒蛋白viperin的表达是否抑制狂犬病病毒的复制,我们构建了viperin的真核表达载体,通过瞬时转染BSR-T7细胞,过表达viperin,证实了过表达viperin能抑制狂犬病病毒rRC-HL的复制,在一定范围内狂犬病病毒N、P和M蛋白在细胞中的表达量明显被抑制,狂犬病病毒滴度显著降低。通过筛选稳定表达viperin的BHK-21细胞系,感染狂犬病病毒,发现稳定表达viperin的BHK-21细胞系对狂犬病病毒rRC-HL株的抑制效果更加明显,显著抑制了病毒蛋白的合成。同样稳定表达viperin的BHK-21细胞系显著抑制广西分离强毒Ⅰ群和Ⅲ群代表株GX01和GXN119。在此基础上,为了进一步探索viperin抑制狂犬病病毒主要功能区域,本实验构建了缺失viperin N末端两亲性的a螺旋区域及突变S-腺苷甲硫胺酸酶基序的突变体,测定这些突变体抑制狂犬病病毒的效果,结果显示viperin的抑制狂犬病病毒复制活性区域主要位于其N末端,其突变后抗狂犬病病毒能力显著下降。S-腺苷甲硫胺酸酶基序的3个关键氨基酸(C83A/C87A/C90A)突变后,其抑制狂犬病病毒的能力也明显下降。先前的研究发现viperin的N末端可结合细胞的内质网及脂滴,扰乱细胞膜的脂筏结构来抑制病毒的出芽与释放。为了探索viperin抑制狂犬病病毒复制的机理,本实验就viperin对脂筏的重要组成成分胆固醇和鞘磷脂的生物学作用进行探索。首先在BSR-T7细胞中过表达viperin,检测细胞中胆固醇和鞘磷脂变化情况。结果显示,过表达viperin能够降低细胞中胆固醇和鞘磷脂的含量,推测viperin可能通过破坏胆固醇和鞘磷脂以抑制狂犬病病毒释放。同时添加分别抑制胆固醇和鞘磷脂的药物MβCD和Myroicin,发现破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂对狂犬病病毒的吸附与穿入无影响,但对狂犬病病毒的出芽与释放有抑制作用,证实了破坏细胞的胆固醇和鞘磷脂是viperin抑制狂犬病病毒复制的重要途径之一。Viperin是干扰素诱导蛋白,受干扰素的诱导和调控,本实验进一步探索狂犬病病毒感染巨噬细胞上调viperin基因的上游信号传导通路,应用芯片技术对狂犬病病毒感染RAW264.7细胞后,84个免疫应答基因及几个主要看家基因转录谱进行了分析。结果显示,狂犬病病毒感染巨噬细胞后12、24和36 h三个时间点都上调2倍以上的基因共有26个；12 h上调2倍以上、24和36 h无明显变化的基因有2个；12和24 h上调2倍以上、36 h无明显变化的基因有1个；12h无变化、24和36 h上调2倍以上的基因有15个；12和24 h无变化、36 h上调2倍以上的基因有17个；12、24和36 h三个时间点都没有明显变化(小于2倍)的基因有25个；12、24和36 h三个时间点都下调2倍以上的基因有1个。其中,Cxcl10基因在12、24和36 h三个时间点上调倍数分别为377.85、333.14和183.12倍；IFNβ基因分别为370.07、68.12和13.09倍。狂犬病病毒感染RAW264.7细胞也会引起TLRs不同程度升高,TLR3基因分别为156.68、380.03和164.66倍,TLR2和TLR8基因呈一定程度的上调表达,TLR1、TLR4、TLR5、 TLR6、TLR7和TLR9也有较显著的变化。上述实验证明TLRs参与了狂犬病病毒感染RAW264.7细胞的免疫信号传导。根据TLR4能够识别病毒的囊膜蛋白传递免疫信号和激活机体固有免疫、TLR3识别双链RNA (dsRNA)和病毒复制过程中产生的中间复合物的特性,本研究使用流式细胞术证明了巨噬细胞感染狂犬病病毒后,显著上调TLR4的表达,说明狂犬病病毒激活了TLR4然而再用灭活的狂犬病病毒孵育巨噬细胞,发现保留了基本自然特性的狂犬病病毒囊膜糖蛋白能够诱导viperin的表达。进一步用TLR4的特异性抑制剂(TAK-242)阻断TLR4信号的传导,显示viperin的表达量显著减少,说明TLR4参与了识别狂犬病病毒并诱导viperin表达。为了验证TLR3与狂犬病病毒相互作用及其诱导viperin表达的固有免疫反应,本实验首先构建了TLR3基因敲除的TLR3-/- RAW264.7细胞系,感染狂犬病病毒,检测viperin蛋白的变化情况,显示敲除了TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7细胞可显著推迟并减少viperin蛋白表达量,说明TLR3参与识别狂犬病病毒核酸并诱导viperin的表达。NF-κB和IRF3是固有免疫信号通路中两个重要的免疫因子,用NF-κB的特异性抑制剂抑制其通路的信号传导,然后感染狂犬病病毒,结果显示抑制NF-κB通路的信号传导,viperin的表达量几乎不受影响,说明狂犬病病毒上调viperin与NF-κB信号通路没有直接关联性。用IRF3的特异性抑制剂格尔德霉素抑制处理细胞后,可抑制IRF3的分子伴侣Hsp90,使viperin的表达时间推迟并减少表达量,说明IRF3参与了狂犬病病毒诱导viperin表达的调控。综上所述,狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7可诱导干扰素诱导蛋白viperin表达,viperin表达具有抑制狂犬病强毒、弱毒复制的作用。这种抑制作用主要通过破坏RAW264.7细胞膜的胆固醇和鞘磷脂,阻碍病毒的出芽和释放。进一步的芯片技术研究发现,巨噬细胞RAW264.7感染狂犬病病毒时多数TLRs的表达受到影响。当用狂犬病病毒感染敲除TLR3基因的TLR3-/- RAW264.7细胞,viperin的表达量比正常RAW264.7细胞显著减少并延后；用TLR4抑制剂TAK-242可抑制狂犬病病毒诱导viperin的产生；因此,viperin的诱导受上游TLR3/TLR4的调控。通过系统研究,阐明了狂犬病病毒感染巨噬细胞RAW264.7诱导viperin的分子通路,具有重要的理论价值和实践意义。
【关键词】：狂犬病病毒 viperin TLR3 TLR4
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S855.3
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-20
• 第一章 文献综述20-36
• 1.1 狂犬病的流行病学21-22
• 1.1.1 狂犬病的全球概况21
• 1.1.2 狂犬病病毒的宿主范围21-22
• 1.1.3 狂犬病的临床症状22
• 1.2 狂犬病病毒分子结构22
• 1.3 狂犬病的发病机制22-25
• 1.3.1 糖蛋白和致病性23-24
• 1.3.2 细胞死亡和致病性24
• 1.3.3 狂犬病病毒逃避先天免疫反应24-25
• 1.4 狂犬病病毒感染的免疫应答25-26
• 1.5 狂犬病病毒感染与Toll样受体通路的免疫反应26-30
• 1.5.1 Toll样受体及其与狂犬病病毒的相互作用27-28
• 1.5.2 狂犬病病毒感染的免疫应答涉及TLR728-29
• 1.5.3 狂犬病病毒感染MyD88敲除的小鼠29-30
• 1.6 Viperin30-34
• 1.6.1 Viperin的结构与特征31
• 1.6.2 Viperin表达调控31-32
• 1.6.3 Viperin的抗病毒功能32-33
• 1.6.4 Viperin在免疫信号与免疫反应中的作用33
• 1.6.5 病毒逃避与利用viperin33-34
• 1.7 挑战与展望34-36
• 第二章 Viperin抑制狂犬病病毒的复制是通过破坏细胞膜胆固醇和鞘磷脂36-75
• 2.1 材料37-39
• 2.1.1 细胞和病毒37
• 2.1.2 质粒37
• 2.1.3 抗体37
• 2.1.4 主要仪器37-38
• 2.1.5 主要的试剂38
• 2.1.6 引物设计与合成38-39
• 2.2 方法39-47
• 2.2.1 重组狂犬病病毒的拯救39-40
• 2.2.2 病毒效价的滴定40
• 2.2.3 不同细胞对狂犬病病毒的易感性实验40
• 2.2.4 Western blot40-42
• 2.2.5 大肠杆菌培养基的配制42
• 2.2.6 制备感受态细胞大肠杆菌DH5α所用试剂的配制42
• 2.2.7 细胞培养所用溶液42
• 2.2.8 细胞或小鼠脑组织总RNA的提取42-43
• 2.2.9 QRT-PCR43-44
• 2.2.10 real-time PCR反应条件的优化44
• 2.2.11 标准曲线的制作44-45
• 2.2.12 实时定量PCR实验45
• 2.2.13 BHK-GFP或BHK-viperin-GFP细胞系构建45
• 2.2.14 MβCD与myriocin对细胞毒性的检测45
• 2.2.15 免疫共沉淀45-46
• 2.2.16 MβCD对细胞胆固醇、myriocin对细胞鞘磷脂降解情况46
• 2.2.17 过表达viperin对细胞胆固醇和鞘磷脂的影响试验46-47
• 2.3 结果47-70
• 2.3.1 rRC-HL狂犬病病毒株的拯救47
• 2.3.2 狂犬病病毒效价的测定47-48
• 2.3.3 不同细胞对狂犬病病毒的易感性实验48
• 2.3.4 狂犬病病毒感染不同细胞后viperin基因的差异表达48-51
• 2.3.5 瞬时过表达viperin抑制狂犬病病毒的复制51-54
• 2.3.6 稳定表达viperin抑制狂犬病病毒的复制54-60
• 2.3.7 Viperin抑制狂犬病病毒复制能力与其蛋白表达量成正比60
• 2.3.8 Viperin抑制狂犬病病毒的功能区定位60-62
• 2.3.9 免疫共沉淀试验证实viperin不结合狂犬病病毒的N、P和M蛋白62-63
• 2.3.10 过表达viperin抑制狂犬病病毒的出芽63-64
• 2.3.11 Viperin对细胞膜鞘磷脂和胆固醇的影响64-65
• 2.3.12 MβCD/Myroicin对狂犬病病毒吸附和穿入的影响65-66
• 2.3.13 MβCD/Myroicin对狂犬病病毒出芽的影响66-70
• 2.4 讨论70-74
• 2.5 小结74-75
• 第三章 Viperin抑制狂犬病病毒复制受上游TLR3/4通路调控75-98
• 3.1 材料76-77
• 3.1.1 细胞/动物和病毒76
• 3.1.2 主要的试剂76
• 3.1.3 抗体76
• 3.1.4 主要仪器见2.1.476-77
• 3.2 方法77-79
• 3.2.1 细胞总RNA的提取见2.2.877
• 3.2.2 Real-time RT-PCR方法的建立见2.2.1277
• 3.2.3 Western blot见2.2.477
• 3.2.4 免疫应答基因转录谱分析77-78
• 3.2.5 流式细胞术分析RAW264.7细胞TLR4的表达情况78
• 3.2.6 NF-kB、IRF3和TLR4的抑制试验78
• 3.2.7 TLR3基因敲除的RAW264.7细胞系的建立78-79
• 3.3 结果79-94
• 3.3.1 狂犬病病毒感染RAW264.7细胞免疫应答基因转录普分析79-85
• 3.3.2 TLR4对viperin的影响85-88
• 3.3.3 TLR3对viperin的影响88-89
• 3.3.4 狂犬病病毒感染对TLR3/4信号传导通路相关因子的影响89-91
• 3.3.5 NF-kB信号通路对狂犬病病毒上调viperin的影响91-92
• 3.3.6 狂犬病病毒上调viperin通过IRF3/Hsp90信号通路92-94
• 3.3.7 狂犬病病毒与viperin相互作用示意图94
• 3.4 讨论94-97
• 3.5 小结97-98
• 第四章 结论98-99
• 参考文献99-113
• 附章一：广西狂犬病病毒GXHXN株的全基因测序及生物学特性初步研究113-137
• 摘要113-114
• ABSTRACT114-116
• 1 材料与方法116-121
• 1.1 细胞与动物116
• 1.2 单克隆抗体116-117
• 1.3 样品117
• 1.4 引物设计与合成117-118
• 1.5 病毒RNA的提取118
• 1.6 聚合酶链式反应(PCR)118
• 1.7 测序118
• 1.8 基因序列分析118-120
• 1.9 单克隆抗体间接荧光免疫法(IFA)检测GXHXN株N蛋白和G蛋白的抗原性120-121
• 2 结果121-132
• 2.1 样品检测121-122
• 2.2 GXHXN株的致病性122-124
• 2.3 GXHXN株的神经嗜性、生长特性与GXN119比较124-125
• 2.4 GXHXN株的N和G蛋白的抗原性分析125-129
• 2.5 GXHXN的全基因测序与遗传进化树分析129
• 2.6 GXHXN株基因变异情况分析129-132
• 讨论132-134
• 小结134-135
• 参考文献135-137
• 附章二：拯救P-eGFP融合表达的重组狂犬病病毒株及应用于病毒中和抗体快速检测137-156
• 摘要137-138
• ABSTRACT138-140
• 2.1 材料与方法140-142
• 2.1.1 主要试验材料140
• 2.1.2 构建重组病毒的引物设计与合成140
• 2.1.3 重组质粒pRV-eGFP的构建140-141
• 2.1.4 重组病毒rRV-eGFP的拯救141
• 2.1.5 标准RFFIT法检测犬血清抗狂犬病毒中和抗体的主要步骤141
• 2.1.6 新型改良RFFIT-eGFP法检测犬血清抗狂犬病毒中和抗体的主要步骤141-142
• 2.2 结果142-152
• 2.2.1 重组狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA成功构建142-143
• 2.2.2 重组病毒rRV-eGFP成功拯救并鉴定携带eGFP基因143-146
• 2.2.3 拯救重组病毒rRV-eGFP的P蛋白与eGFP蛋白融合表达146-147
• 2.2.4 重组病毒rRV-eGFP与亲本毒株rRC-HL特性相似147-149
• 2.2.5 RFFIT法和RFFIT-eGFP法检测结果的比较149-150
• 2.2.6 RFFIT-eGFP法检测方法的优越性150-152
• 讨论152-153
• 小结153-154
• 参考文献154-156
• 致谢156-158
• 攻读学位期间发表的学术论文目录158-159

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