我国部分种鸡群REV感染血清学调查与亚单位疫苗探索

发布时间：2017-03-23 22:01

  本文关键词：我国部分种鸡群REV感染血清学调查与亚单位疫苗探索，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：禽网状内皮组织增生病毒感染不仅能够引起鸡发生肿瘤和严重的免疫抑制,还常常污染弱毒疫苗,并可通过垂直传播造成鸡群禽网状内皮组织增生病毒较高的感染率。目前除了检测和淘汰外,尚无有效商品化疫苗可以用于禽网状内皮组织增生病毒的控制。此外,在科学研究中,由于禽网状内皮组织增生病毒与人的获得性免疫缺陷综合征病毒具有非常相似的基因组结构,还常常被用于作为一种模式病毒来研究逆转录病毒的分子生物学机制特征,如病毒的准种演变机制等。为了摸清我国大型种鸡场和某些地方品系鸡中禽网状内皮组织增生病毒的流行状况,本研究利用血清学方法调查了我国部分大型种鸡场的禽网状内皮组织增生病毒的感染情况,并通过某一特定鸡群观察了禽网状内皮组织增生病毒在鸡群中的准种多样性,对于禽网状内皮组织增生病毒亚单位疫苗的研制做了尝试和探索。摘要如下:1.我国部分种鸡场REV感染的血清学调查为了调查我国部分大型种鸡场禽网状内皮组织增生病毒感染的状况,本研究从我国4个曾祖代鸡场采集了536份血清样本,从8个祖代鸡场采集了6557份血清样品,从4个父母代鸡场采集了312份血清样品,对列入我国地方品系鸡保种基因库的20种地方品系鸡共采集了1306份血清样品。所有采集的血清样品采用ELISA抗体检测试剂盒检测REV抗体,对出现读数但判定为阴性的辅助IFA进行检测,以评估这些大型种鸡场的REV感染状况。结果显示在曾祖代、祖代和父母代中所检测的REV抗体阳性率分别为0-31%,0-47%,4.23-42.50%。地方品系鸡总计1306份血清样品中有高达746份血清样品经ELISA和IFA检测均为REV抗体阳性,抗体阳性率为57.12%;所有鸡群均有不同程度的感染,阳性率最高达到100%。基于现有数据分析发现,种鸡群随着代次的升高感染率显著降低,不同代次的外来品系种鸡感染率显著高于地方品种,种鸡开产前感染率高于开产后感染率。外来品系经ELISA鉴定为阳性的血清样品经IFA鉴定均为阳性,但是某些经ELISA检测其读数的OD值在临界值附近的血清样品经IFA检测可见典型的绿色荧光,也可判定为REV抗体阳性,显示IFA比ELISA在REV抗体结果判定上灵敏度更高一些。本调查表明,RVE感染在我国某些大型种禽场中是比较普遍的,在我国传统的地方品系基因库中感染尤其严重,应该引起高度重视。2.同一鸡群不同个体中REV的分离鉴定与准种多样性比较对某鸡场发生肿瘤病例的某海兰褐种鸡群随机抽取8只鸡,无菌采集抗凝血接种鸡胚成纤维细胞和DF-1细胞进行针对MDV、ALV和REV的分离和鉴定,最终分离到4株REV野毒,分别定名为HB1201、HB1202、HB1203、HB1204。对4株REV进行env基因的扩增和克隆,每个毒株选取10个阳性克隆子进行测序和序列分析,以env基因分析和比较4个毒株的准种差异。检测发现,HB1201-HB1204四个毒株的env基因全长均为1761bp,编码587个氨基酸,4个毒株其env基因的10个克隆子之间核酸同源性分别为99.6%-100%、99.7%-100%、99.7%-100%、99.7%-100%,其准种群体中优势变种比例分别为20%(4/10)、30%(3/10)、60%(6/10)、30%(3/10),显示不同个体感染REV后优势变种比例具有明显差异。对4个毒株的优势变种分析发现,HB1201、HB1202、HB1203的三个毒株的优势变种env基因相互之间为100%同源,表明这3只鸡感染REV后的优势变种是一致的,但比例有所差异;HB1204与上述3株REV相比其优势变种的env基因共有2个核酸位点发生了变化并引起了2个推导氨基酸位点的改变,显示同一鸡群中REV的优势变种在不同个体中发生了变化。通过对4个毒株的优势变种与以前不同年份发表的参考序列比较发现,env基因同源性在94.7%-100%之间,说明REV优势变种稳定性总体较高,但准种群体内仍发生变异,保持动态变化。3.REV-env蛋白与不同C3d分子串联表达载体的构建及亚单位疫探索为了探索研制能够有效诱发鸡体REV中和抗体的REV亚单位疫苗,本研究通过计算机软件模拟并选取了禽网状内皮组织增生病毒env基因一段抗原决定簇集中的1050bp的片段作为抗原蛋白目标基因。为了增强其免疫效果,本研究利用RT-PCR的方法从鸡肝脏中扩增获得鸡C3d基因,并分别将2,3和4个C3d分子与鸡网状内皮增生症病毒env-1050片段连接,经Eco R I/Xho I双酶切后与原核表达载体PET-30a连接构建了禽网状内皮组织增生病毒env蛋白与不同C3d分子串联表达的原核表达载体,经过SDS-PAGE和Western blot鉴定结果均显示PET-30a-env-1050、PET-env-1050-2C3d和PET-env-1050-3C3d均获得成功表达,但PET-env-1050-4C3d未能表达,可能是由于片段较长的原因。镍柱亲和纯化结果显示纯化蛋白符合预期大小,纯度约为90%。本研究将REV env-1050分别与2,3和4个C3d分子连接,经Eco R I/Xho I双酶切后与表达载体p CDNA-FLAG连接构建了禽网状内皮组织增生病毒env-1050与不同C3d分子串联表达的真核表达载体,SDS-PAGE和Western blot结果均显示构建的真核表达载体p CDNA-FLAG-env-1050、p CDNA-FLAG-1050-2C3d、p CDNA-FLAG-env-1050-3C3d和p CDNA-FLAG-env-1050-4C3d均获得了成功表达。将上述原核表达蛋白和真核表达蛋白经纯化后分别各免疫10只15周龄SPF鸡,二次免疫后三周开始采集血清,应用禽网状内皮组织增生病毒抗体ELISA检测试剂盒和IFA方法分别检测血清中抗体,连续观察5周,结果显示除p CDNA-FLAG-env-1050-4C3d表达蛋白免疫组有2只鸡呈现抗体阳性外,其他均为阴性。本研究显示仅使用部分抗原基因片段,即使有多个C3d的免疫增强作用,其免疫效果也是有限的。
【关键词】：禽网状内皮组织增生病毒 血清学调查 准种 C3d
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 中文摘要12-15
• ABSTRACT15-17
• 1 前言17-40
• 1.1 禽网状内皮组织增殖病病毒研究进展17-28
• 1.1.1 REV病原学17-21
• 1.1.1.1 病毒基因组结构及功能介绍17-20
• 1.1.1.2 REV的复制20-21
• 1.1.2 REV的分类21-22
• 1.1.3 REV的致病性22-24
• 1.1.4 REV的流行病学24-25
• 1.1.4.1 宿主24
• 1.1.4.2 病毒的传播24-25
• 1.1.5 REV诊断25-28
• 1.1.5.1 病毒分离26
• 1.1.5.2 血清学检测26-27
• 1.1.5.3 鉴别诊断27-28
• 1.1.6 预防控制28
• 1.1.6.1 免疫接种28
• 1.1.6.2 治疗措施28
• 1.1.6.3 防控措施28
• 1.2 病毒的准种及其演变28-33
• 1.2.1 准种的基本特性29-30
• 1.2.2 准种的作用与意义30
• 1.2.3 准种的研究方法30-31
• 1.2.3.1 限制性片段长度多态性分析30
• 1.2.3.2 单链构像多态性分析30-31
• 1.2.3.3 异源双链泳动分析法31
• 1.2.3.4 毛细管电泳法31
• 1.2.3.5 PCR-质粒克隆-序列比对分析31
• 1.2.4 病毒准种的产生及其在不同选择压力下的演变31-33
• 1.2.5 REV对HIV研究的模式作用33
• 1.3 核酸疫苗与分子免疫佐剂33-40
• 1.3.1 核酸疫苗研究进展情况33-35
• 1.3.1.1 定义33
• 1.3.1.2 核酸疫苗构成33
• 1.3.1.3 核酸疫苗分类33-34
• 1.3.1.4 核酸疫苗的作用机制34-35
• 1.3.1.5 核酸疫苗接种方法和途径35
• 1.3.1.6 接种剂量35
• 1.3.2 分子佐剂补体C3D研究进展35-40
• 1.3.2.1 C3D的分子佐剂作用35-37
• 1.3.2.2 C3D对体液免疫应答的影响37-38
• 1.3.2.3 C3D对细胞免疫应答的影响38
• 1.3.2.4 C3D对细胞因子表达类型的影响38
• 1.3.2.5 对抗原特异性体液和细胞免疫的负向调节作用38-39
• 1.3.2.6 C3D分子间的直接串联39
• 1.3.2.7 小鼠品系对C3D免疫作用的影响39-40
• 1.3.2.8 不同动物C3D的研究40
• 2 材料与方法40-69
• 2.1 试验材料40-45
• 2.1.1 鸡胚、细胞与毒株40
• 2.1.2 单克隆抗体与标记抗体40
• 2.1.3 细胞培养试剂及耗材40
• 2.1.4 检测试剂盒40-41
• 2.1.5 分子生物试剂41
• 2.1.6 常规试剂41
• 2.1.7 常规溶液的配制41-43
• 2.1.8 原核表达载体与真核表达载体43-44
• 2.1.9 主要仪器设备44-45
• 2.2 试验方法45-69
• 2.2.1 我国部分种鸡场血清样品的采集与保存45-46
• 2.2.2 我国部分种鸡场REV抗体的ELISA检测46
• 2.2.3 血清样品的IFA鉴定46-48
• 2.2.3.1 鸡胚成纤维细胞的制备46-47
• 2.2.3.2 REV感染阳性细胞的制备与鉴定47
• 2.2.3.3 待检血清样品的IFA鉴定47-48
• 2.2.4 某蛋鸡群REV感染样品采集与病毒的分离鉴定48-49
• 2.2.5 待检血清学样品的ELISA检测49-50
• 2.2.6 分离毒株ENV基因的克隆与序列分析50-54
• 2.2.6.1 感染细胞DNA的提取50
• 2.2.6.2 引物的设计与合成50-51
• 2.2.6.3 ENV基因的PCR扩增51
• 2.2.6.4 PCR产物的电泳鉴定51
• 2.2.6.5 PCR扩增产物的回收与纯化51-52
• 2.2.6.6 PCR产物与T载体的连接52
• 2.2.6.7 感受态细胞的制备52-53
• 2.2.6.8 连接产物的转化53
• 2.2.6.9 重组菌的筛选和鉴定53
• 2.2.6.10 重组质粒的酶切鉴定53-54
• 2.2.7 不同分离株的准种比较及其分子演化54
• 2.2.8 REV的ENV片段与不同C3D组合原核表达载体构建与表达54-64
• 2.2.8.1 细胞的制备与病毒的增殖54-55
• 2.2.8.2 REV ENV基因的克隆55-57
• 2.2.8.3 鸡C3D基因的克隆57-59
• 2.2.8.4 构建不同重复C3D与ENV-1050融合PCR产物59-61
• 2.2.8.5 构建含HIS标签的PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D重组表达载体61
• 2.2.8.6 诱导PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D表达61
• 2.2.8.7 蛋白质电泳61-63
• 2.2.8.8 表达产物的WESTERN-BLOT检测63
• 2.2.8.9 PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D和PET-ENV10503C3D的纯化63-64
• 2.2.9 REV的ENV片段与不同C3D组合真核表达载体构建与表达64-68
• 2.2.9.1 将TPA标签克隆到PCDNA-FLAG载体中64-65
• 2.2.9.2 ENV与不同重复C3D串联真核表达载体的构建65-67
• 2.2.9.3 ENV与不同重复C3D串联真核表达载体的表达67-68
• 2.2.9.4 重组蛋白的SDS-PAGE检测68
• 2.2.9.5 重组蛋白的WESTERN-BLOT鉴定68
• 2.2.10 重组蛋白的免疫效果初探68-69
• 3 试验结果69-90
• 3.1 我国部分种鸡群REV感染的血清学调查69-77
• 3.1.1 曾祖代种鸡场中REV抗体阳性率统计69
• 3.1.2 祖代种鸡场中REV抗体阳性率统计69-70
• 3.1.3 父母代种鸡场中REV抗体阳性率统计70-71
• 3.1.4 地方品系种鸡中REV抗体阳性率统计71-73
• 3.1.5 ELISA和IFA鉴定结果的对比73
• 3.1.6 曾祖代中不同品系之间感染率比较分析73-74
• 3.1.7 曾祖代中不同品系之间感染率比较分析74-75
• 3.1.8 地方品系开产前后感染率比较分析75
• 3.1.9 ELISA 和 IFA 鉴定结果的对比75-77
• 3.2 某种鸡群REV准种多样性分析77-79
• 3.2.1 病毒的分离鉴定77
• 3.2.2 不同分离株的准种分析与比较77
• 3.2.3 不同分离株优势变种的分子演化77-79
• 3.3 不同C3D片段组合与ENV基因的串联原核表达79-86
• 3.3.1 病毒的鉴定79
• 3.3.2 ENV基因的克隆79-80
• 3.3.3 鸡C3D基因的克隆80-82
• 3.3.4 不同重复C3D序列构建82-83
• 3.3.5 不同重复C3D序列与ENV-1050 PCR产物融合83
• 3.3.6 构建PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D重组表达载体83-84
• 3.3.7 诱导PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D和PET-ENV10504C3D表达84-85
• 3.3.8 WESTERN-BLOT检测85-86
• 3.3.9 PET-ENV-1050, PET-ENV10502C3D, PET-ENV10503C3D纯化86
• 3.4 不同C3D片段组合与ENV基因的串联真核表达86-88
• 3.4.1 将TPA标签克隆到PCDNA-FLAG载体中86
• 3.4.2 不同C3D片段组合与ENV基因的串联真核表达载体构建86-88
• 3.4.3 WESTERN-BLOT鉴定真核表达情况88
• 3.5 重组蛋白的免疫效果初探88-90
• 4 讨论90-96
• 4.1 我国不同鸡群中REV的流行状况分析90-91
• 4.2 IFA和ELISA在REV血清学检测中的比较91-92
• 4.3 同一鸡群不同个体中REV准种比较92-93
• 4.4 REV不同重复C3D与ENV-1050融合蛋白的表达与免疫效果初探93-96
• 5 本文结论96-97
• 参考文献97-110
• 致谢110-111
• 攻读学位期间发表论文情况111

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 孙淑红;崔治中;曲立新;;母源抗体对禽网状内皮增生病病毒感染诱发生长迟缓和免疫抑制的预防作用[J];中国农业科学;2006年11期

  本文关键词：我国部分种鸡群REV感染血清学调查与亚单位疫苗探索，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：264628