犬肛周腺肿瘤的转录组学及其在诊断中的潜在应用

发布时间：2017-03-25 01:02

  本文关键词：犬肛周腺肿瘤的转录组学及其在诊断中的潜在应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：犬肛周腺肿瘤(Hepatoid gland tumours)起源于犬肛周腺组织,其发病率约占犬全部肛门周围肿瘤的80%,高发于未去势老年公犬,在雄性犬的肿瘤中发病率排名第三。国内外关于犬肛周腺肿瘤的研究主要集中在病理形态分析和临床治疗等方面,针对犬肛周腺肿瘤的分子生物学研究少有报道,目前对犬肛周腺肿瘤发生、发展和转移的分子机制尚不清楚。本项研究首次采用高通量测序技术对肛周腺肿瘤与正常肛周腺组织进行了差异表达基因分析,旨在探索该肿瘤发生机理,寻找有望成为临床诊断的特异性分子标记物,从而为该肿瘤的早期临床诊断与治疗提供有益的依据。本次测序的10例犬肛周腺肿瘤样本均来源于老年公犬,平均年龄为12.8岁,其中高分化肛周腺腺瘤4例、中分化肛周腺腺瘤3例、高分化肛周腺腺癌1例、中分化肛周腺腺癌2例。涵盖了除罕见的肛周腺上皮瘤外所有该肿瘤分型。6例正常肛周腺组织也来源于老年公犬,平均年龄为11.6岁。上述样本均经石蜡切片H.E.染色,按照WHO肿瘤分型标准鉴定了组织结构及细胞成分。本文采用IlluminaHiSeq TM 2500高通最转录组RNA-scq测序技术对犬肛周腺肿瘤的组织和对应的正常肛周腺组织分别进行测序,并通过实时定量PCR随机验证了9个候选基因,其表达结果与转录组测序结果一致,证实了测序结果的可靠性。测序结果发现肿瘤组与正常对照组比较差异表达基因588个,其中上调基因23个,下调基因565个,达到统计学上差异极显著水平的基因(FC≥2, FDR0.05)有94个。发现转录异构体isoforms中差异转录本827个,其中上调24个,下调803个,达到差异极显著水平的(FC≥2, FDR 0.05)26个。通过对GO富集分析,共有120个基因得到归类注释,其中细胞过程类别(Cellular Component)富集基因数最多为59个、生物过程类别(Biological Process)基因37个、分子功能类别(Molecular Function)24个。KEGG分析发现有470个基因涉及信号通路262个,其中代谢信号通路(Metabolic pathways)涉及基因数最多为16个基因,其次为嗅觉信号通路(Olfactory transduction)涉及12个基因、代谢通路(Metabolism)涉及8个基因,此外癌症信号通路(Pathways in cancers)、信号转导通路(SignalTransduction)、PI3K-Akt各涉及7个基因。经过数据分析发现了一些上下调显著的基因可能与肛周腺肿瘤发生、发展密切相关,如：MMP-1(基质金属蛋白酶-1)、FGF7(成纤维细胞生长因子7)、GST(谷胱甘肽转移酶)、ECM(细胞外基质)等基因。在插入缺失方面,发现肛周腺肿瘤的样本中单核苷酸多样性(SNP)、插入或缺失(Indel)的数值比对照组显著增多,表明肛周腺肿瘤中可能存在大量基因插入或缺失现象,且肛周腺肿瘤中新增的SNP、InDe1基因具有组织特异性。本次研究还针对差异表达显著的上调基因MMP-1和下调基因FGF7进行了免疫组化染色观察,经光密度值(OD)分析,发现MMP-1在正常肛周腺和肛周腺肿瘤细胞胞浆中均有表达,OD差异不显著,不适合作为特异性分子标记物。FGF7在正常肛周腺组织胞浆中强烈表达,而在肿瘤细胞胞浆中表达量显著下降,OD值差异显著,有望作为肛周腺肿瘤的特异性诊断标记物。
【关键词】：犬肛同腺肿瘤 转录组 Illumina测序 实时定量PCR 分子标记物
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.292
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 英文缩略词9-10
• 第一章 文献综述10-28
• 1.1 犬肛周腺的介绍10-13
• 1.1.1犬肛周腺肿瘤的介绍11
• 1.1.2 犬肛周腺肿瘤分型11-12
• 1.1.3 犬肛周肿瘤的临床诊断12-13
• 1.1.4 肛周腺肿瘤的治疗13
• 1.2 犬肛周腺肿瘤发病原因13-14
• 1.3 犬肛周腺瘤研究进展14-18
• 1.3.1 肿瘤分子标记物研究进展14-16
• 1.3.2 非编码RNA研究进展16-17
• 1.3.3 紧密连接蛋白(Claudins,CLDNs)研究进展17-18
• 1.4 犬肿瘤的转录组分析方法18-26
• 1.4.1 表达序列标签(Expressed Sequence tags,EST)19
• 1.4.2 基因表达序列分析(Serial analysis of gene expression,SAGE)19-20
• 1.4.3 DNA微阵列(DNA microarray)20-22
• 1.4.4 RNA测序技术(RNA-seq)22-25
• 1.4.5 转录组研究方法的比较25-26
• 1.5 研究目的与意义26-27
• 1.6 实验技术路线27-28
• 第二章 应用高通量测序技术对犬肛周腺瘤转录组的研究28-68
• 2.1 试验材料28-33
• 2.1.1 试验动物及样品采集28
• 2.1.2 样本的组织病理学鉴定28-31
• 2.1.3 石蜡切片主要试剂与仪器31-32
• 2.1.4 测序用主要试剂32
• 2.1.5 实验设备32
• 2.1.6 溶液配制32-33
• 2.2 试验方法33-39
• 2.2.1 总RNA提取33
• 2.2.2 测序文库的建立33-36
• 2.2.3 测序36-37
• 2.2.4 测序数据的处理37-38
• 2.2.5 转录本表达水平的确定及标准化38
• 2.2.6 差异表达转录本、新转录本,可变剪切以及SNP/InDel的鉴定38-39
• 2.2.7 差异表达基因GO富集分析39
• 2.2.8 差异表达基因KEGG富集分析39
• 2.3 结果与分析39-62
• 2.3.0 样品的分类及RNA质量检测结果39-41
• 2.3.1 Reads数据质量统计41-42
• 2.3.2 基因表达及差异分析42-47
• 2.3.3 差异基因表达基因GO及KEGG富集分析47-61
• 2.3.4 插入/缺失的筛查61-62
• 2.3.5 可变剪切的筛查62
• 2.4 讨论62-68
• 2.4.1 MMP-1(基质金属蛋白酶-1)在肛周腺肿瘤和正常组织中的差异表达62-63
• 2.4.2 FGF(成纤维细胞生长因子)在肛周腺肿瘤和正常组织中的差异表达63-64
• 2.4.3 KEGG富集通路中与肛周腺肿瘤发生的关系64-65
• 2.4.4 非编码RNA与肛周腺肿瘤65-66
• 2.4.5 H19基因与肛周腺肿瘤的关系66-67
• 2.4.6 Ig lambda链基因与肿瘤免疫67-68
• 第三章 实时定量PCR对犬肛周腺肿瘤转录组差异基因的验证68-73
• 3.1 材料和方法68-70
• 3.1.1 样品收集68
• 3.1.2 试验用品与设备68
• 3.1.3 实时荧光定量PCR68-70
• 3.2 结果70-71
• 3.3 讨论71-73
• 第四章 差异表达基因的免疫组化研究73-85
• 4.1 免疫组化切片材料73
• 4.2 主要试剂73-74
• 4.3 主要仪器与耗材74
• 4.3.1 主要仪器74
• 4.3.2 主要耗材74
• 4.4 主要试剂配制74-75
• 4.5 免疫组织化学切片制作方法75
• 4.6 切片观察75-76
• 4.7 结果76-83
• 4.8 讨论83-85
• 总结85-88
• 1 结论85-86
• 2 创新点86
• 3 未来研究方向86-88
• 参考文献88-100
• 附录100-108
• 致谢108-110
• 作者简历110-111

  本文关键词：犬肛周腺肿瘤的转录组学及其在诊断中的潜在应用，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：266411