植物保护研究所,研究生院

发布时间：2017-03-25 01:05

  本文关键词：植物保护研究所,研究生院，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：Lux R家族的蛋白是一类在细菌中广泛存在的调控因子,它能够与目的基因的启动子特异结合,调控相关基因的表达。瓜类细菌性果斑病的病原菌为西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli),为革兰氏阴性菌(G-)。该病害能够为害西瓜、甜瓜等葫芦科作物,给我国的西甜瓜种植业造成了极大的经济损失。西瓜嗜酸菌群体感应系统的Aac R(Aave-3810)为编码接受群体感应信号分子的蛋白,属于为Lux R家族。西瓜嗜酸菌的群体感应系统参与调控病菌的致病性、IV型菌毛、运动性、生长速度及生物膜形成能力。为深入探索Lux R家族在西瓜嗜酸菌Ac-5菌中的调控作用,本论文利用同源重组双交换的原理,筛选了7个Lux R家族功能基因进行了缺失突变及互补菌株;通过致病力及相关生物学特性的比较分析,研究了其在西瓜嗜酸菌致病机制中的调控作用。1.Ac-5菌株Lux R家族功能蛋白生物信息学分析对西瓜嗜酸菌的全基因组分析结果表明,Lux R家族共包含了13个Lux R同源蛋白。其结构域组成共分为4种类型。通过氨基酸序列同源性比对发现,13个Lux R同源蛋白可以分成3组。2.Lux R家族部分功能基因缺失突变株及互补菌株的构建利用三亲交配的方法,筛选到Lux R家族7个功能基因的突变株及其相应的互补菌株,并验证其准确性。3.Ac-5菌株Lux R家族部分基因缺失突变株及其互补菌株的致病力测定致病力测定结果表明,突变株Δlux R-1121,Δlux R-3591、Δlux R-3862、Δlux R-4229及Δlux R-4382致病力均显著下降(P0.05)。西瓜嗜酸菌Ac-5菌株对西瓜幼苗的致病力明显高于甜瓜幼苗。4.部分Lux R家族功能基因缺失突变株及互补菌株的生物学特性测定分别对植物西瓜嗜酸菌野生型Ac-5菌株、各基因缺失突变株及对应的互补菌株进行了相关生物学特性测定结果表明,突变株运动能力显著下降(P0.01),其中突变株Δlux R-1121、Δlux R-3862和Δlux R-4382的运动能力基本缺失;经透射电子显微镜观察,突变株Δlux R-4382不能形成鞭毛;q PCR实验结果发现,突变株中fli R,fli C基因的表达量都有不同程度的下降;蹭行运动测定结果显示,突变株Δlux R-3591和野生型Ac-5菌株一样,能够在单菌落周围形成水纹状的蹭行运动轨迹,而其它突变株丧失蹭行运动的能力;生物膜形成能力的对比研究发现,突变株Δlux R-3591与野生型Ac-5菌株均不能形成生物膜,其它突变株生物膜形成能力增强。
【关键词】：西瓜嗜酸菌 LuxR家族 多样性 功能
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432
【目录】：

• 摘要6-7
• Abstract7-12
• 英文缩略表12-13
• 第一章 前言13-23
• 1.1 植物病原菌的致病机制13-16
• 1.1.1 瓜类细菌性果斑病13
• 1.1.2 西瓜嗜酸菌特性、为害症状和发病规律13-14
• 1.1.3 西瓜嗜酸菌的遗传多样性14-15
• 1.1.4 防治措施15-16
• 1.2 LuxR家族调控因子概述16-22
• 1.2.1 群体感应系统(Quorum sensing)16-18
• 1.2.2 LuxR solo调节因子18-21
• 1.2.3 其他类型的LuxR调控因子21
• 1.2.4 西瓜嗜酸菌QS系统21-22
• 1.3 本研究的目的意义及技术路线22-23
• 1.3.1 本研究的目的意义22
• 1.3.2 技术路线22-23
• 第二章 LuxR家族蛋白生物信息学分析23-29
• 2.1 实验材料23
• 2.2 实验方法23-24
• 2.2.1 LuxR家族蛋白序列比对分析23
• 2.2.2 LuxR家族蛋白序列结构域预测23-24
• 2.2.3 Ac-5 菌株LuxR-1577蛋白的三级结构模拟24
• 2.3 结果与分析24-27
• 2.3.1 西瓜嗜酸菌Ac-5 菌株LuxR家族蛋白序列分析24-26
• 2.3.2 西瓜嗜酸菌Ac-5 菌株LuxR家族蛋白结构域预测26
• 2.3.3 Ac-5 菌株LuxR-1577蛋白的三级结构模拟26-27
• 2.4 讨论27-29
• 第三章 LuxR家族部分基因突变株及互补菌株的构建29-45
• 3.1 实验材料29-31
• 3.1.1 菌株及质粒29-30
• 3.1.2 培养基及主要试剂30-31
• 3.2 实验方法31-36
• 3.2.1 LuxR家族部分基因突变株的构建及鉴定31-35
• 3.2.2 LuxR家族部分基因互补菌株的构建及鉴定35-36
• 3.3 结果与分析36-44
• 3.3.1 LuxR家族部分基因重组蔗糖致死载体的验证36-37
• 3.3.2 LuxR家族部分基因缺失突变株的筛选及验证37-42
• 3.3.3 LuxR家族部分基因互补载体的鉴定42-43
• 3.3.4 LuxR家族部分基因互补株的筛选与鉴定43-44
• 3.4 讨论44-45
• 第四章 LuxR家族部分基因调控致病力及相关基因表达分析45-53
• 4.1 实验材料45-46
• 4.2 实验方法46-48
• 4.2.1 致病性的测定46
• 4.2.2 供试菌株RNA的提取46-47
• 4.2.3 RNA反转录合成第一链cDNA47
• 4.2.4 实时荧光定量 (real-time qPCR) PCR47-48
• 4.3 结果与分析48-52
• 4.3.1 Ac-5 菌株LuxR家族基因缺失对西瓜幼苗致病性的影响48-50
• 4.3.2 Ac-5 菌株LuxR家族基因缺失对甜瓜幼苗致病性的影响50-51
• 4.3.3 Ac-5 菌株LuxR家族基因缺失对T3SS基因的表达的影响51-52
• 4.4 讨论52-53
• 第五章 LuxR家族部分基因调控西瓜嗜酸菌生物学特性分析53-61
• 5.1 实验材料53
• 5.1.1 菌株、质粒及培养条件53
• 5.1.2 培养基53
• 5.2 实验方法53-54
• 5.2.1 运动性的测定53-54
• 5.2.2 菌株蹭行运动 (Twitching) 能力测定54
• 5.2.3 生物膜的测定54
• 5.3 结果与分析54-60
• 5.3.1 运动性的测定结果及分析54-57
• 5.3.2 菌株蹭行运动 (Twitching) 测定结果及分析57-58
• 5.3.3 菌株生物膜的测定结果及分析58-60
• 5.4 讨论60-61
• 第六章 全文结论61-64
• 6.1 西瓜嗜酸菌LuxR家族调控因子生物信息学分析61
• 6.2 成功筛选了西瓜嗜酸菌Ac-5 菌株LuxR部分基因的突变株及互补菌株61
• 6.3 证实西瓜嗜酸菌LuxR家族功能基因调控Ac-5 菌株的致病力61-62
• 6.4 证实西瓜嗜酸菌LuxR家族功能基因调控Ac-5 菌株的生物学特性62-63
• 6.5 后续研究展望63-64
• 参考文献64-72
• 致谢72-73
• 作者简历73

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