核受体LXRα抗奶牛乳腺炎作用及其激动剂筛选

发布时间：2017-03-25 01:13

  本文关键词：核受体LXRα抗奶牛乳腺炎作用及其激动剂筛选，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛乳腺炎是造成奶牛养殖业重大经济损失的主要疾病之一，根据临床有无明显炎症反应可分为临床型乳腺炎和隐性乳腺炎。大肠杆菌等革兰氏阴性菌感染主要引起临床型乳腺炎，该类病原细胞壁中的LPS能够激活奶牛组织细胞TLR4信号转导通路，引起炎性细胞因子大量分泌，是导致乳腺剧烈炎症反应的主要毒力因子，兽医临床处置中除给予必要的抗菌药物之外，能否有效控制乳腺组织剧烈的炎症反应，是决定奶牛临床型乳腺炎治疗最终转归的关键环节，然而受乳中药物残留等食品安全因素的限制，在生产实践中还缺乏安全有效的抗炎药物，因此寻找新的抗炎靶点及药物来控制乳腺炎症反应，对乳腺炎的防治具有重要意义。传统中草药因药物残留较低，相对安全，在奶牛乳腺炎治疗药物开发中一直被寄予厚望。LXRα是核受体超家族的主要成员之一，与代谢、感染、免疫等众多病理生理过程都有密切关系，在乳业研究领域内由于LXRα被激活后不但能够提高乳脂率，，还呈现出能够降低组织炎症反应的抗炎功能，可能是一种潜在的抗炎新靶点而备受关注。本论文以核受体LXRα作为研究对象，通过建立LPS刺激TLR4信号转导通路的体内小鼠乳腺炎模型和体外小鼠、奶牛乳腺上皮细胞等炎症模型，利用已知人工合成的LXRα激动剂T0901317对LXRα进行激活，以验证对乳腺炎症的抗炎效果；然后采用LXRα报告基因等方法，对治疗乳腺炎常见传统中药方剂所含有的五味子酯甲A、百里香酚、矢车菊素、甘草皂苷、柴胡皂苷、山姜素、大黄素、小檗碱、黄芩苷、黄芩素、连翘酯苷、姜黄素、绿原酸、紫云英苷和蒲公英甾醇等15种中药单体成分进行检验，以筛选出LXRα天然激动剂并对其抗炎效果进行评价；最后对优选出的抗炎效果较好的中药单体成分进行抗乳腺炎作用及机制的进一步深入研究，为奶牛乳腺炎抗炎药物的研发提供实验依据及参考。 首先，建立LPS诱导的小鼠乳腺炎模型、LPS刺激的奶牛和小鼠乳腺上皮细胞炎症模型，在上述模型中加入人工合成的LXRα激动剂T0901317，通过组织病理观察；MPO活性检测；TNF-α等炎性细胞因子水平分析；NF-κB和IRF3等TLR4信号转导通路下游核转录因子变化检测；以及LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞炎症模型中脂筏胆固醇含量变化分析等，以验证LXRα激活的抗乳腺炎效果，并初步探索其抗炎作用机制。研究结果表明，LXRα被激活后可以降低LPS诱导的小鼠乳腺组织炎性损伤；MPO活性及乳腺组织中炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平；在LPS刺激的奶牛乳腺上皮细胞中， LXRα被激活后可以抑制LPS诱导的炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因表达；在LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞中，LXRα被激活后可以降低脂筏中胆固醇含量，干扰LPS诱导的TLR4分子向脂筏募集；抑制TLR4信号通路下游核转录因子NF-κB和IRF3磷酸化。以上结果证实，LXRα激活可降低LPS诱导的乳腺炎症反应水平；LXRα可能是通过降低脂筏胆固醇含量，干扰TLR4向脂筏募集，从而抑制TLR4信号转导通路而发挥其抗炎作用。 其次，建立LXRα报告基因检测体系，在该实验体系中分别加入五味子酯甲A等15种中药单体成分，从中筛选LXRα天然激动剂；在LPS刺激的小鼠和奶牛乳腺上皮细胞炎症模型中，确定筛选出的LXRα天然激动剂安全剂量范围后，对比评价在各自安全剂量范围内对炎性细胞因子TNF-α的抑制效果，从而优选出抗炎效果最强的LXRα天然结构激动剂。结果显示，矢车菊素、甘草皂苷、柴胡皂苷、蒲公英甾醇等4种中药单体均可激活LXRα；在LPS刺激的小鼠和奶牛乳腺上皮细胞中，安全剂量范围内矢车菊素、甘草皂苷、柴胡皂苷、蒲公英甾醇等4种中药单体均可抑制LPS诱导的TNF-α水平升高而呈现出抗炎效果，其中矢车菊素对TNF-α的抑制效果最强，其次为蒲公英甾醇、甘草皂苷和柴胡皂苷。以上结果证实，矢车菊素、甘草皂苷、柴胡皂苷、蒲公英甾醇等4种中药单体均可作为LXRα天然激动剂，4种中药单体激活LXRα后均呈现出抗乳腺炎活性，其中矢车菊素的抗炎作用效果最强。 最后，对矢车菊素的抗乳腺炎作用及机制展开深入研究，在LPS诱导的小鼠乳腺炎模型和小鼠乳腺上皮细胞上，通过观察组织病理变化，检测MPO活性及TNF-α等炎性细胞因子水平，进一步验证矢车菊素的抗乳腺炎作用；通过检测脂筏胆固醇含量，观察TLR4向脂筏募集，分析TLR4通路下游核录分子NF-κB和IRF3激活，以阐述矢车菊素激活LXRα的抗炎作用机制；最后通过敲低LXRα进行确证。结果表明，矢车菊素可以降低LPS诱导的小鼠乳腺组织炎性损伤，剂量依赖性地降低MPO活性及乳腺组织中TNF-α、IL-1β和IL-6等炎性细胞因子表达；在LPS刺激的小鼠乳腺上皮细胞中，矢车菊素激活LXRα后，可上调ABCG1表达，降低脂筏中胆固醇含量，干扰TLR4向脂筏募集，抑制NF-κB和IRF3激活。敲低LXRα后，矢车菊素的抗炎作用消失。以上结果证实，矢车菊素可以降低LPS诱导的乳腺炎症反应水平，具有确实的抗乳腺炎作用效果；矢车菊素通过激活LXRα-ABCG1，降低脂筏中胆固醇的含量，干扰TLR4向脂筏募集，抑制TLR4信号转导通路的作用机制而发挥其抗乳腺炎作用。 通过上述研究，本论文证实了LXRα可以作为乳腺炎抗炎治疗的潜在靶点，从15种中药单体中筛选出矢车菊素、甘草皂苷、柴胡皂苷、蒲公英甾等4种LXRα天然激动剂，确定了矢车菊素抗炎效果最强，并初步证实矢车菊素通过激活LXRα-ABCG1，抑制TLR4信号通路而发挥其抗炎作用。以上结果可为基于LXRα为靶点的乳腺炎抗炎药物研发提供初步的实验数据和参考。
【关键词】：LXRα TLR4 矢车菊素 细胞因子 脂筏 乳腺炎
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.23
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-13
• 英文缩写表13-14
• 前言14-16
• 第一篇 文献综述16-50
• 第一章 奶牛乳腺炎的研究进展16-33
• 1 奶牛乳腺炎的危害16-18
• 2 引起乳腺炎的病原微生物18-20
• 3 奶牛乳腺炎的发病因素20-22
• 4 奶牛乳腺炎的分类22-24
• 5 奶牛乳腺炎的发病机制24-27
• 6 奶牛乳腺炎的诊断27-29
• 7 奶牛乳腺炎的防治29-33
• 第二章 核受体 LXRα研究进展33-50
• 1 核受体 LXR 概述33
• 2 核受体 LXR 功能33-38
• 3 核受体 LXRα相关疾病38-43
• 4 核受体 LXRα抗炎作用43-45
• 5 核受体 LXRα激动剂类型45-50
• 第二篇 研究内容50-99
• 第一章 核受体 LXRα抗乳腺炎作用50-75
• 1 材料50-55
• 2 方法55-63
• 3 结果63-72
• 4 讨论72-74
• 5 小结74-75
• 第二章 核受体 LXRα激动剂筛选及评价75-84
• 1 材料75-76
• 2 方法76-77
• 3 结果77-82
• 4 讨论82-83
• 5 小结83-84
• 第三章 矢车菊素抗乳腺炎作用及机制研究84-99
• 1 材料84-85
• 2 方法85-87
• 3 结果87-95
• 4 讨论95-98
• 5 小结98-99
• 结论99-100
• 参考文献100-122
• 导师简介122-123
• 作者简介123-126
• 致谢126

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

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本文编号：266456