细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用及调控机制

发布时间：2017-03-25 11:00

  本文关键词：细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用及调控机制，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：细胞缝隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication, GJIC)是哺乳动物细胞间普遍存在的一种通讯方式,在细胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理过程中具有重要作用。镉是一种重要的工业和环境污染物,危害人和动物的健康,肝脏是镉的重要靶器官之一。镉不仅引起肝细胞凋亡,还能抑制肝细胞GJIC,影响细胞缝隙连接蛋白的表达和分布,但GJIC在镉暴露肝脏损伤过程中的作用机制尚不明确。本研究在体外用2.5、10 μmol/L镉和50 μmol/L红景天苷(Salidroside, Sal)单独或联合作用BRL 3A细胞6、12h；并选择80-100g雌性SD大鼠,50 mg/L镉自由饮水,35 mg/kg B.W. Sal每天灌胃一次,单独或联合处理12周,建立动物模型。通过细胞生物学和分子生物学方法,探讨镉致大鼠肝脏损伤过程中GJIC的变化以及其在钙离子通路、MAPK通路以及自噬调控镉致肝细胞毒性损伤中的作用机制,并阐明Sal在上述过程中的保护作用。为揭示镉致肝脏毒性损伤的分子机制提供依据。1、镉致大鼠肝细胞损伤及Sal的保护作用为了研究镉对大鼠肝细胞毒性的影响,本试验通过体内、体外试验检测镉及Sal对SD大鼠细胞活力、细胞形态、细胞指数、肝脏脏器指数、肝脏组织病理学变化和肝细胞超微结构的变化。体外试验结果表明,不同剂量镉(2.5、5、10、20 μmol/L)暴露致BRL 3A细胞皱缩、细胞间隙增大、死细胞增多、细胞核收缩、变形、破裂,核染色质浓缩成点状分布、细胞存活率下降、细胞指数(CI)下降,并且呈明显的时间-剂量效应。不同浓度(25、50、100 μmol/L) Sal对CI无显著影响,提示Sal在所选浓度范围内基本无细胞毒性。染镉组与50 μmol/L Sal联合处理明显减轻镉导致的CI下降速度。这一结果表明,50 μmol/L Sal对2.5 μmol/L Cd和10 μmol/L Cd导致的细胞毒性有保护作用。体内试验结果表明,染镉组(50 mg/kg B.W.)大鼠肝脏脂肪变性,肝细胞排列紊乱,中央静脉淤血。Cd与Sal联合处理组大鼠肝脏脂肪变性相对于染镉组有明显好转。透射电镜观察肝细胞超微结构发现,染镉组的肝细胞核染色质明显收缩,细胞核固缩、浓染；线粒体肿胀,线粒体嵴模糊、断裂甚至崩解,部分形成空泡。Sal可明显减轻Cd对大鼠肝细胞线粒体和细胞核的损伤。2、镉对大鼠GJIC的影响为了研究镉对GJIC的影响,通过染料划痕示踪法检测GJIC,免疫印迹法检测连接蛋白Cx43、Cx32,实时定量PCR检测Cx43、Cx32相关基因表达,RTCA检测细胞指数,免疫荧光观察Cx43在BRL 3A细胞上的分布,免疫电镜观察连接蛋白在肝细胞上的分布,Transwell共培养体系观察镉暴露受损肝细胞通过GJIC对正常肝细胞的影响。结果表明,Cd能下调BRL 3A细胞中Cx43、Cx32的表达水平以及Cx43磷酸化水平(p0.05或p0.01),动物试验也证实Cd可下调Cx32的表达。GJIC抑制剂GA与Cd联合处理加剧了Cd致CI的下降,提示GA加剧了Cd的细胞毒性。镉暴露细胞可导致与之相邻的正常细胞损伤,添加Sal以及GJIC抑制剂GA可明显减轻镉暴露受损细胞对正常细胞的毒性损伤作用。Sal可抑制Cd对GJIC的相关影响。提示Cd引起的GJIC抑制具有双重作用,保护正常细胞免受Cd暴露细胞的毒性损伤作用以及进一步加强Cd对镉暴露受损细胞的毒性作用。3、GJIC参与调节钙离子通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤为了探讨钙离子通路在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用以及红景天苷的保护机制,本试验通过体外添加钙离子通路相关抑制剂,用流式细胞术检测BRL 3A细胞内钙离子浓度、免疫印迹法检测BRL 3A细胞钙离子通路相关蛋白、实时定量PCR检测钙离子通路相关基因表达、RTCA检测细胞指数。结果表明,镉能引起BRL 3A细胞[Ca2+]i升高(p0.01),通过添加细胞内游离钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制镉导致的细胞指数和细胞存活率的下降,添加Sal也有类似的作用。用EGTA螯合细胞外钙离子可抑制镉介导的胞存活率的下降,内质网钙泵抑制剂TG可促进镉介导的细胞存活率的下降(p0.01或p0.05)。体内和体外试验都表明镉能下调CaM mRNA的表达,说明CaM参与了重金属镉对肝细胞的毒性损伤过程。GJIC抑制剂GA单独处理可引起细胞[Ca2+]i升高,GA还进一步促进镉致BRL3A细胞钙超载,细胞外钙离子螯合剂EGTA可部分抑制镉诱导的BRL 3A细胞[Ca2+]i升高,但EGTA与GA联合则恶化镉诱导的BRL 3A细胞[Ca2+]i升高,TG单独处理就能引起[Ca2+]i的升高以及细胞成活率下降,与镉联合则进一步加剧对细胞的损伤作用(p0.01)。表明GJIC与钙离子通路关系密切,诱导细胞[Ca2+]i升高是镉发挥细胞毒性的重要途径,镉引起的肝细胞钙超载主要是由于镉诱导细胞内钙库(尤其是内质网)的释放导致的,Sal可作为保护剂通过GJIC与钙离子通路发挥对镉致肝细胞毒性损伤的保护作用。4、GJIC参与调节MAPK通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤为了探讨镉致大鼠肝细胞损伤中MAPK通路与GJIC的交互作用以及红景天苷的保护机制,本试验通过体外添加MAPK通路相关抑制剂,如ERK制剂U0126、JNK制剂SP600125、p38抑制剂SB202190,同时结合保护剂Sal、GJIC抑制剂GA,用染料划痕示踪法检测GJIC,免疫印迹法检测BRL3A细胞MAPK通路相关蛋白表达,实时定量PCR检测Cx32基因表达；RTCA检测细胞指数,Transwell共培养体系观察MAPK通路在镉暴露受损肝细胞通过GJIC对正常肝细胞损伤的影响。结果表明,镉致BRL 3A细胞以及大鼠肝细胞发生毒性损伤过程中MAPK关键信号分子ERK、JNK、p38MAPK发生磷酸化,通过添加Sal可以明显抑制ERK、JNK、p38MAPK蛋白的活化进而减轻镉的细胞毒性损伤作用。添加相关抑制剂发现,抑制ERK以及p38MAPK蛋白磷酸化可明显抑制镉诱导的BRL 3A细胞指数的下降,抑制JNK磷酸化则对细胞指数的影响较小。抑制MAPKs的活化可上调Cx32 mRNA的表达和Cx43蛋白的表达,改善镉诱导的GJIC的抑制作用,同时对镉损伤细胞通过GJIC对正常细胞的毒性损伤作用具有明显的保护作用。而抑制GJIC对镉诱导BRL 3A细胞MAPK通路的激活几乎无影响。5、细胞缝隙连接通讯在镉诱导大鼠肝细胞自噬中的作用为了探讨镉引起的自噬与GJIC的关系,本研究通过体外添加自噬特异性抑制剂羟氯喹(CQ)以及自噬诱导剂雷帕霉素(RAP),同时结合GJIC抑制剂甘珀酸(CBX),用单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察晚期自噬溶酶体,免疫印迹法检测自噬蛋白LC3、连接蛋白Cx43的表达,实时定量PCR检测自噬相关基因Atg-5、Atg-7、Beclin-1表达,探讨镉暴露大鼠肝细胞过程中自噬与GJIC的变化。结果表明,MDC染色证实了镉诱导BRL 3A细胞发生自噬,同时自噬相关基因Beclin-1、Atg5、Atg7表达上调(p0.01),LC3Ⅱ蛋白表达增多,并具有明显的剂量-效应关系(p0.01)。抑制自噬可进一步促进镉所引起的细胞指数的下降,促进自噬的结果刚好相反,提示镉诱导的自噬对细胞具有保护作用。添加GJIC抑制剂CBX可促进镉诱导的BRL 3A细胞自噬。自噬对GJIC起负调节作用,自噬促进镉引起的GJIC的下调,同时下调的还有Cx43的表达。
【关键词】：大鼠肝细胞 镉 细胞缝隙连接通讯 钙离子 MAPK 自噬 红景天苷
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.3
【目录】：

• 中文摘要3-6
• ABSTRACT6-14
• 符号说明14-18
• 第一部分 文献综述18-51
• 第一章 镉的肝脏毒性18-21
• 1 镉的危害18-19
• 2 镉在体内的转运19-20
• 2.1 金属硫蛋白参与转运镉19
• 2.2 钙离子参与转运镉19-20
• 3 镉的肝脏毒性20-21
• 3.1 炎症因子和粘附分子介导的镉的肝毒性21
• 3.2 离子稳态失衡介导的镉的肝毒性21
• 3.3 巯基酶失活以及氧化应激介导的镉的肝毒性21
• 第二章 镉与细胞缝隙连接通讯21-24
• 1 细胞缝隙连接通讯概述21-24
• 2 镉对细胞缝隙连接通讯的影响24
• 第三章 钙离子通路与细胞缝隙连接通讯24-27
• 1 钙离子通路概述24-26
• 2 钙离子通路与细胞缝隙连接通讯的关系26
• 3 镉对钙离子通路的影响26-27
• 第四章 MAPK通路与细胞缝隙连接通讯27-29
• 1 MAPK通路概述27-28
• 2 MAPK通路与细胞缝隙连接通讯的关系28
• 3 镉对MAPK通路的影响28-29
• 第五章 自噬与细胞缝隙连接通讯29-31
• 1 自噬概述29-30
• 2 自噬与细胞缝隙连接通讯的关系30
• 3 镉对自噬的影响30-31
• 第六章 红景天苷的研究进展31-34
• 1 红景天苷简介31-32
• 2 红景天苷药理作用32-34
• 2.1 抗氧化32
• 2.2 抗凋亡32-33
• 2.3 抗肿瘤33-34
• 本研究的目的和意义34-35
• 参考文献35-51
• 第二部分 试验研究51-134
• 第一章 镉致大鼠肝细胞损伤及Sal的保护作用51-67
• 1 材料和方法51-54
• 1.1 实验动物51
• 1.2 实验细胞株51-52
• 1.3 主要仪器和试剂52
• 1.4 主要溶液的配制52
• 1.5 动物试验分组及染毒52-53
• 1.6 BRL 3A细胞培养53
• 1.7 MTT法检测镉对BRL 3A细胞存活率的影响53
• 1.8 xCELLigence细胞实时分析技术(RTCA)检测细胞指数(CI)53
• 1.9 Hoechst 33258荧光染色观察细胞核形态53
• 1.10 大鼠肝脏病理组织学观察53-54
• 1.11 大鼠肝脏组织超微结构观察54
• 1.12 统计学分析54
• 2 结果54-63
• 2.1 不同浓度镉处理不同时间对BRL 3A细胞形态影响54-55
• 2.2 镉对BRL 3A细胞存活率的影响55-56
• 2.3 镉对细胞核形态学的影响56-57
• 2.4 xCELLigence系统检测镉暴露对BRL 3A细胞指数的影响57-60
• 2.5 镉与红景天苷联合对肝脏脏器系数(OSI)的影响60-61
• 2.6 镉与红景天苷联合对肝脏组织病理学的影响61-62
• 2.7 镉与红景天苷联合对肝细胞超微结构的影响62-63
• 3 讨论63-64
• 参考文献64-67
• 第二章 镉对大鼠肝脏细胞缝隙连接通讯的影响67-87
• 1 材料和方法67-74
• 1.1 实验动物67
• 1.2 实验细胞株67-68
• 1.3 主要仪器和试剂68
• 1.4 主要溶液的配制68
• 1.5 动物试验分组及染毒68-69
• 1.6 BRL 3A细胞培养69
• 1.7 划痕染料标记示踪技术(SL/DT)测定GJIC69
• 1.8 激光共聚焦显微镜观察缝隙连接蛋白Cx43分布69
• 1.9 xCELLigence细胞实时分析技术(RTCA)检测细胞指数(CI)69
• 1.10 免疫印迹检测细胞缝隙连接通道相关蛋白表达69-70
• 1.11 qRT-PCR检测连接蛋白Cx43、Cx32基因表达70-71
• 1.12 免疫电镜观察肝脏连接蛋白分布71-73
• 1.13 Transwell共培养体系研究GJIC73-74
• 1.14 统计学方法74
• 2 结果74-83
• 2.1 镉对大鼠肝细胞GJIC的影响及红景天苷的保护作用74-77
• 2.2 镉与红景天苷对大鼠肝细胞连接蛋白表达的影响77-78
• 2.3 镉与红景天苷对大鼠肝细胞连接蛋白分布的影响78-80
• 2.4 GJIC在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用80-83
• 3 讨论83-85
• 参考文献85-87
• 第三章 细胞缝隙连接通讯调节钙离子通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤87-104
• 1 材料和方法87-90
• 1.1 实验动物87
• 1.2 实验细胞株87-88
• 1.3 主要仪器和试剂88
• 1.4 主要溶液的配制88
• 1.5 动物试验分组及染毒88
• 1.6 BRL 3A细胞培养88
• 1.7 划痕染料标记示踪技术(SL/DT)测定GJIC88
• 1.8 xCELLigence细胞实时分析技术(RTCA)检测细胞指数(CI)88
• 1.9 qRT-PCR检测CaM基因表达88-89
• 1.10 流式细胞术检测BRL 3A细胞内钙离子浓度89
• 1.11 MTT法检测细胞存活率89
• 1.12 统计学方法89-90
• 2 结果90-99
• 2.1 镉对BRL 3A细胞内钙离子浓度的影响及红景天的保护作用90
• 2.2 镉对肝细胞钙调蛋白的影响及红景天的保护作用90-91
• 2.3 钙离子通路抑制剂对镉致BRL 3A细胞钙超载的影响91-95
• 2.4 GJIC与钙离子通路在镉致大鼠肝脏毒性损伤中的交互关系95-99
• 3 讨论99-101
• 参考文献101-104
• 第四章 细胞缝隙连接通讯调节MAPK通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤104-119
• 1 材料和方法104-106
• 1.1 实验动物104-105
• 1.2 实验细胞株105
• 1.3 主要仪器和试剂105
• 1.4 主要溶液的配制105
• 1.5 动物试验分组及染毒105
• 1.6 BRL 3A细胞培养105
• 1.7 划痕染料标记示踪技术(SL/DT)测定GJIC105
• 1.8 xCELLigence细胞实时分析技术(RTCA)检测细胞指数(CI)105
• 1.9 qRT-PCR检测Cx32基因表达105-106
• 1.10 免疫印迹检测MAPK通路相关蛋白表达106
• 1.11 Transwell共培养体系研究MAPK通路GJIC的关系106
• 1.12 统计学方法106
• 2 结果106-116
• 2.1 镉对BRL 3A细胞MAPK通路的影响及红景天的保护作用106-108
• 2.2 MAPK通路特异性抑制剂对细胞指数的影响108-110
• 2.3 MAPK通路与GJIC在镉致大鼠肝脏毒性损伤中的交互关系110-116
• 3 讨论116-117
• 参考文献117-119
• 第五章 细胞缝隙连接通讯在镉诱导大鼠肝细胞自噬中的作用119-134
• 1 材料和方法119-121
• 1.1 实验细胞株119-120
• 1.2 主要仪器和试剂120
• 1.3 主要溶液的配制120
• 1.4 BRL 3A细胞培养120
• 1.5 单丹磺酰尸胺(MDC)染色120
• 1.6 划痕染料标记示踪技术(SL/DT)测定GJIC120
• 1.7 xCELLigence细胞实时分析技术(RTCA)检测细胞指数(CI)120
• 1.8 qRT-PCR检测自噬相关基因表达120-121
• 1.9 免疫印迹检测自噬与GJIC相关蛋白表达121
• 1.10 统计学方法121
• 2 结果121-130
• 2.1 镉致BRL 3A细胞发生自噬121-124
• 2.2 自噬诱导剂与自噬抑制剂对BRL 3A细胞指数的影响124-125
• 2.3 细胞缝隙连接通讯对镉诱导BRL 3A细胞自噬的影响125-128
• 2.4 自噬对镉抑制BRL 3A细胞缝隙连接通讯的影响128-130
• 3 讨论130-131
• 参考文献131-134
• 全文结论134-135
• 致谢135-136
• 攻读博士学位期间发表论文136-137

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前9条

1 郑元林,艾晓杰,韩正康,陈杰;异丙肾上腺素对大鼠肝细胞氮代谢及6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响[J];上海交通大学学报(农业科学版);2001年04期

2 郑元林,韩正康,陈杰,艾晓杰,刘根桃;塞曼特罗 (Cimaterol)对大鼠肝细胞氮代谢及 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的影响[J];中国兽医学报;2002年01期

3 江青艳,张守全,劳全林,高淑静,傅伟龙;模拟微重力条件下大鼠肝细胞的三维培养及其功能[J];动物学报;2002年06期

4 贾敬亮;徐丽娜;杜金梁;纪丽莎;马玉忠;;绿原酸对原代大鼠肝细胞CYP3A1的影响[J];中国兽医杂志;2009年01期

5 丁卫民;陈坤;李金贵;;牛膝水煎液及多糖对H_2O_2损伤大鼠肝细胞的影响[J];扬州大学学报(农业与生命科学版);2013年04期

6 倪慧;王玲玲;韩涛;刘学忠;;镉对大鼠肝细胞基因甲基化的影响[J];上海畜牧兽医通讯;2013年05期

7 臧琳;杨焕民;郭景茹;计红;李士泽;;腺病毒介导的hsp70对大鼠肝细胞氧化应激的保护作用[J];畜牧与兽医;2012年S1期

8 朱家桥;王玲玲;程来洋;王棋文;王亨;刘学忠;刘宗平;;镉对体外培养大鼠肝细胞DNA甲基化的影响[J];中国兽医学报;2014年05期

9 ;[J];;年期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 戴静;孟琴;;原代大鼠肝细胞体外拟组织化培养的研究[A];第三届全国化学工程与生物化工年会论文摘要集（上）[C];2006年

2 张蒙;汤朝武;陈璧;;大鼠肝细胞传代培养及其形态学观察[A];中华医学会第五次全国烧伤外科学术会议论文汇编[C];1997年

3 张锦周;申治国;庄志雄;杨淋清;;1,2-二氯乙烷对大鼠肝细胞损理机理的初步研究[A];第五届广东省环境诱变剂学会暨第三届广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术交流会论文集[C];2006年

4 于向民;方丽华;;苯巴比妥投入对大鼠肝细胞增生的细胞化学研究[A];解剖学杂志——中国解剖学会2002年年会文摘汇编[C];2002年

5 曹安民;施畅;廖明阳;;酮康唑对原代培养大鼠肝细胞的毒作用及其机制研究[A];中国毒理学会第四届全国学术会议论文（摘要）集[C];2005年

6 贾珍容;邱银生;王大菊;顾性初;王程;;齐多夫定对原代大鼠肝细胞的毒性评价[A];2007年全国药物毒理学会议论文集[C];2007年

7 高蔚娜;郭长江;安代志;吴健全;张琪;颜贤忠;;槲皮素对氧化应激大鼠肝细胞代谢组的影响[A];中国营养学会第十次全国营养学术会议暨第七届会员代表大会论文摘要汇编[C];2008年

8 高蔚娜;郭长江;吴健全;韦京豫;杨继军;;槲皮素对氧化应激大鼠肝细胞氨基酸代谢的影响[A];膳食变迁对民众健康的影响：挑战与应对——第二届两岸四地营养改善学术会议学术报告及论文摘要汇编[C];2010年

9 赖炽香;杨文礼;王玉民;;钚—239对大鼠肝细胞超微结构的影响[A];第四次全国电子显微学会议论文摘要集[C];1986年

10 高蔚娜;郭长江;吴健全;韦京豫;杨继军;;槲皮素对氧化应激大鼠肝细胞氨基酸代谢的影响[A];中国营养学会特殊营养第七届学术会议会议资料汇编[C];2009年

中国博士学位论文全文数据库 前4条

1 邹辉;细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用及调控机制[D];扬州大学;2015年

2 陈玮莹;五味子对CCl_4中毒大鼠肝细胞修复作用分子机理的研究[D];汕头大学;2003年

3 汪纪仓;镉致大鼠肝细胞毒性机理研究[D];扬州大学;2010年

4 叶娟;SOCS3基因下调对追赶生长IUGR大鼠肝细胞糖代谢调控及胰岛素抵抗机制研究[D];华中科技大学;2012年

中国硕士学位论文全文数据库 前10条

1 张永泽;西格列汀对糖尿病大鼠肝细胞内质网应激的干预研究[D];福建医科大学;2015年

2 裘虹霞;拟组织化培养大鼠肝细胞用于药物的研究[D];浙江大学;2006年

3 孙冬冬;重组大鼠白细胞介素18（rrIL-18）的毕赤酵母表达及其对大鼠肝细胞和肿瘤细胞的作用研究[D];河南师范大学;2013年

4 韩超;蛋氨酸负载对大鼠肝细胞同型半胱氨酸代谢的影响[D];中国人民解放军军事医学科学院;2012年

5 赖招霞;微囊藻毒素LR致大鼠肝细胞氧化应激对修复基因的影响[D];福建医科大学;2010年

6 谢菲;大鼠肝细胞GnRH受体的表达及其影响的研究[D];第四军医大学;2008年

7 乔娜丽;疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85a蛋白表达的影响[D];暨南大学;2008年

8 钱小兰;低剂量微囊藻毒素对原代大鼠肝细胞促增殖效应的分子机制研究[D];复旦大学;2013年

9 王巧燕;FoxA3和Hnf4α促进大鼠肝细胞体外增殖和功能维持的研究[D];河南师范大学;2014年

10 邹立;五味子对四氯化碳中毒大鼠肝细胞E-cadherin表达的影响[D];汕头大学;2008年

  本文关键词：细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用及调控机制，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：267062