应用基因随机突变提高鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白质免疫原性的研究

发布时间：2017-03-27 21:22

  本文关键词：应用基因随机突变提高鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白质免疫原性的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：鸡球虫病是一类由专性细胞内寄生的艾美耳球虫引起的肠道原虫疾病。据估计每年全世界用于预防和治疗球虫病成本会超过30亿美元,中国每年约有30多亿人民币。目前球虫病的防控主要依靠药物与疫苗,随着耐药虫株的出现和针对抗球虫药物的立法限制,人们更加重视免疫预防。市场上的疫苗主要为多种鸡艾美耳球虫活卵囊的混合,具有很好的免疫保护效果,但是由于活疫苗存在安全问题以及较高的生产成本,研究者们将更多的精力用于以亚单位为基础的新型分子疫苗的研制。新型分子疫苗研制依靠具有较好抗原性以及免疫原性的抗原,由于球虫复杂的抗原结构以及生活史,抗原鉴定的难度以及抗原免疫原性筛选的限制阻碍了亚单位疫苗研制的进展。研究者们也开展了大量的研究来改善抗原的免疫保护效果,包括新佐剂的研制,益生菌诱导的非特异性免疫等,但是这些都不能从根本上改善抗原的免疫原性。因此,改善已有疫苗可能是一个快速和有效的方法。定向进化被广泛用于蛋白质工程领域,其中重要的应用之一就是改善抗原的免疫原性。关键氨基酸的改变对于抗原的免疫反应和免疫识别有很大影响,比如可逆抑制宿主的免疫反应、影响T细胞的激活、改善蛋白质免疫原性等,使用随机突变构建基因突变库是定向进化常用的方法之一。EtMIC家族蛋白质在球虫移行、入侵宿主细胞以及胞内生存方面有重要的作用,EtMIC2蛋白质能够在柔嫩艾美耳球虫的整个生活周期内都表达,研究表明EtMIC2基因或者蛋白质能够诱导部分免疫保护反应,是很好的疫苗候选抗原。使用随机突变技术针对EtMIC2进行定向进化,建立基因突变库,使用酵母表面展示技术结合FACS以及动物免疫保护试验筛选目的变异蛋白质,从而改善EtMIC2蛋白质的免疫原性,为球虫疫苗的研制提供基础。1.EtMIC2基因变异库的构建以未突变的EtMIC2基因为模板,使用epPCR进行扩增,获得约33μg的epPCR产物,与T1克隆载体连接后转入大肠杆菌细胞内。经323个氨苄抗性的琼脂平板筛选,获得107个E. coli单克隆。挑取每个平板上的20个单菌落进行PCR鉴定,6460个菌落中有5782个显示为阳性,阳性率达到89.5%。为分析epPCR的突变频率以及突变在基因中的分布,随机选择了阳性克隆中的21变异EtMIC2基因进行序列鉴定,经比对分析在951bp的变异基因中平均出现了6.86+3.21个突变位点,编码的蛋白质有4.19±2.68个氨基酸突变,而且突变位点在EtMIC2基因中随机分布,与我们之前的试验设计一致,结果证明EtMIC2基因突变库构建成功。2. EtMIC2蛋白质变异库的构建PCR扩增基因突变库中的EtMIC2片段,与pCTCON2质粒进行双酶切后连接并转染酿酒酵母EBY100,涂布SD-CAA筛选平板,获得大约为108个酵母克隆。经诱导表面展示后,以兔源抗EtMIC2蛋白质多抗作为一抗,FITC标记的鼠抗兔IgG单抗作为二抗标记展示的变异蛋白质,使用免疫荧光检测蛋白的表达情况。利用100mM DTT还原Agalp和Aga2p之间的二硫键,游离表面展示的变异蛋白,使用兔源抗EtMIC2蛋白质多抗进行Western blot鉴定,结果显示EtMIC2变异蛋白质库成功展示于酵母细胞表面。3.EtMIC2蛋白质变异库的筛选使用流式细胞分选仪对酵母表面展示的蛋白质突变库进行筛选,基于抗原抗体反应亲和力的强弱为筛选条件设三个筛选门(P1,P2和P3),经过三次连续的筛选从108个进样酵母菌中收集到401个具有不同荧光信号强度的细胞。将筛选的酵母菌涂布固体筛选SD-CAA平板,培养后获得19个酵母克隆菌落。为获得变异EtMIC2的基因序列,提取酵母菌中的重组质粒,经PCR扩增与T1载体连接后测序。经分析19个突变株中有5株蛋白质的氨基酸序列未发生突变,6株蛋白质出现终止密码子,剩余7株变异EtMIC2蛋白质分别有2,3,4,6,8,11和14个突变氨基酸。同时使用免疫荧光以及流式细胞仪检测19株变异蛋白质的荧光信号,并分析了与氨基酸突变的关系。4.变异EtMIC2蛋白质抗球虫感染的保护效果评价将EtMIC2以及7种变异基因克隆至pET30a表达质粒并转化大肠杆菌,经诱导表达以及纯化后获得高纯度的蛋白质,并使用鼠源抗His标签单抗进行Western blot进行鉴定。将变异蛋白质与弗氏佐剂乳化后制作亚单位疫苗,在雏鸡7和14日龄时进行颈部皮下多点注射免疫两次,二免后七天除不免疫不感染球虫组(PBS-Ⅰ)外皆接种30,000个柔嫩艾美耳球虫卵囊。结果显示相对于不免疫感染球虫组(PBS-Ⅱ),各蛋白免疫组的体重增长升高显著,卵囊排出以及病变积分均有显著性的降低(P0.05)。与未突变的蛋白质免疫组相比,1130,2119以及2118组中盲肠病变记分以及1130组粪便的卵囊排出均显著降低,ACI结果显示1130和2119组变异蛋白质能够提供良好的保护力,而且2119以及1130免疫组的淋巴细胞针对EtMIC2和EtMIC2变异蛋白质的刺激后的增殖效果,感染球虫后第10天外周血淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例,以及感染球虫第0,10天盲肠黏膜中的sIgA的抗体水平都显著增高(P0.05)。试验结果表明变异后的EtMIC2蛋白质抗球虫的免疫保护效果得到显著改善,筛选到两株变异蛋白质(2119和1130)能够改善抗原的免疫原性以及免疫保护作用。表明通过随机突变改善球虫抗原的免疫原性以及免疫保护力是可行的,这是首次使用随机突变来改变寄生虫蛋白质的免疫原性。
【关键词】：Eimeria tenella EtmIC2 随机突变 酵母表面展示 FACS 免疫原性与免疫保护力
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.31
【目录】：

• 符号说明6-12
• 中文摘要12-15
• ABSTRACT15-19
• 1 前言19-42
• 1.1 鸡球虫病及免疫防治研究进展19-29
• 1.1.1 鸡球虫病病原概述19
• 1.1.2 鸡球虫生活史19-20
• 1.1.3 鸡球虫病危害20-21
• 1.1.4 鸡球虫病药物防治现状21-23
• 1.1.5 鸡球虫免疫研究进展23-25
• 1.1.6 鸡球虫疫苗研究进展25-28
• 1.1.7 艾美耳球虫微线蛋白研究进展28-29
• 1.2 表面展示系统概述及其应用29-33
• 1.2.1 酵母表面展示29-31
• 1.2.2 细胞表面展示31
• 1.2.3 噬菌体表面展示31-32
• 1.2.4 无细胞展示技术32-33
• 1.3 定向进化研究进展33-38
• 1.3.1 定向进化概述33-34
• 1.3.2 基因突变库的构建方法34-36
• 1.3.3 突变文库的高通量筛选策略36-38
• 1.4 定向进化在免疫学方面的应用38-40
• 1.4.1 通过定向进化抗体亲和力成熟38-39
• 1.4.2 定向进化改善抗原的免疫原性以及免疫保护力39-40
• 1.4.3 通过定向进化鉴定靶向配体40
• 1.5 本研究的目的意义40-42
• 2 材料与方法42-65
• 2.1 试验材料42-43
• 2.1.1 试验菌株、寄生虫株与载体42-43
• 2.1.2 试验动物43
• 2.1.3 主要试剂与药品43
• 2.1.4 主要仪器设备43
• 2.1.5 试剂的配制43
• 2.2 试验方法43-65
• 2.2.1 试验设计43-45
• 2.2.2 引物设计45
• 2.2.3 球虫RNA的提取45-46
• 2.2.4 EtMIC2基因的PCR扩增46
• 2.2.5 EtMIC2氨基酸序列同源比对分析46
• 2.2.6 EtMIC2基因的克隆46-47
• 2.2.7 易错PCR扩增EtMIC2基因47-48
• 2.2.8 EtMIC2基因突变库的克隆48-49
• 2.2.9 突变EtMIC2基因库的鉴定49
• 2.2.10 EtMIC2基因库的建立49
• 2.2.11 酵母表面展示重组质粒的构建49-51
• 2.2.12 重组质粒转染酿酒酵母EBY10051-52
• 2.2.13 变异蛋白质库诱导表达52
• 2.2.14 免疫荧光检测变异蛋白质展示52
• 2.2.15 SDS-PAGE和Western blot检测EtMIC2的展示表达52-55
• 2.2.16 FACS筛选目的变异蛋白质55
• 2.2.17 筛选后变异株鉴定55-57
• 2.2.18 变异蛋白质的原核表达系统的构建57-58
• 2.2.19 原核蛋白质诱导表达及纯化58-60
• 2.2.20 亚单位疫苗制备60
• 2.2.21 球虫卵囊活化60-61
• 2.2.22 鸡球虫感染试验设计61-63
• 2.2.23 血清和黏膜抗体的检测63-64
• 2.2.24 鸡淋巴细胞增殖试验64
• 2.2.25 淋巴细胞亚群检测64-65
• 3 试验结果65-89
• 3.1 基因突变库的构建65-71
• 3.1.1 EtMIC2氨基酸序列分析65
• 3.1.2 T1-EtMIC2重组质粒的构建65-66
• 3.1.3 EtMIC2基因突变库的构建66-67
• 3.1.4 突变的EtMIC2基因的序列测定及分析67-71
• 3.2 蛋白质突变库的构建71-72
• 3.2.1 变异EtMIC2蛋白质库的酵母展示重组质粒构建71
• 3.2.2 EtMIC2蛋白质突变库表面展示71-72
• 3.2.3 展示EtMIC2蛋白质Western blot鉴定72
• 3.3 FACS筛选目的突变体72-77
• 3.3.1 流式细胞仪筛选展示变异蛋白质的EBY100酵母菌菌株72-73
• 3.3.2 筛选的EtMIC2变异蛋白质的序列测定73-75
• 3.3.3 七株突变EtMIC2蛋白质的表面展示效果分析75-76
• 3.3.4 EtMIC2变异蛋白质氨基酸突变类型分析76-77
• 3.4 变异蛋白质的原核表达77-80
• 3.4.1 变异蛋白质的原核表达及纯化77-79
• 3.4.2 变异蛋白质Western blot检测79
• 3.4.3 变异蛋白质浓度测定79-80
• 3.5 变异蛋白质免疫保护效果评价80-89
• 3.5.1 体重增长80-81
• 3.5.2 卵囊排出81-82
• 3.5.3 盲肠病变积分82-83
• 3.5.4 抗球虫指数(ACI)83
• 3.5.5 外周血T淋巴细胞增值试验83-84
• 3.5.6 CD4~+和CD8~+T淋巴细胞亚群的检测结果84-86
• 3.5.7 血清IgG抗体检测86-87
• 3.5.8 盲肠黏膜sIgA抗体水平检测结果87-89
• 4 讨论89-97
• 5 结论97-98
• 参考文献98-113
• 附录113-116
• 致谢116-117
• 攻读学位期间论文发表情况117

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李艳琴;王振海;秦建华;李潭清;;鸡球虫病免疫防治研究进展[J];安徽农业科学;2008年13期

2 言慧,陈晓光;常用基因表达系统的特点及其在寄生虫抗原制备中的应用[J];寄生虫与医学昆虫学报;2003年02期

3 马立农,陈杖榴;鸡球虫耐药性的产生及其延缓措施[J];湖北农学院学报;1999年02期

4 谢明权，吴惠贤，张健，彭新宇;柔嫩艾美尔球虫裂殖子免疫原性的研究[J];畜牧兽医学报;1994年04期

  本文关键词：应用基因随机突变提高鸡柔嫩艾美耳球虫EtMIC2蛋白质免疫原性的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：271131