东亚飞蝗Lm-ATP5A功能分析及其在提高绿僵菌毒力中的作用研究

发布时间：2020-06-30 23:31

【摘要】：东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis)是我国重要的迁飞性害虫。长期以来,对其防治主要采用化学农药。然而,长时间、单一、过分依赖化学农药,已导致“3R”问题。绿僵菌已被开发成多种制剂应用于农林害虫的防治,但其致死时间长,严重制约其推广应用。筛选新的杀虫靶标,研制安全、高效的杀虫剂是提高杀虫剂质量的核心路径。ATP合成酶是生物体的能量工厂,它利用质子梯度生成ATP,从而提供细胞和生物体所需90%的能量。基于该酶对生物体的重要性,有可能成为潜在的杀虫靶标。本研究的目标,一是以RNA干扰为技术手段,筛选新的安全、高效的杀虫靶标;二是尝试利用昆虫病原真菌表达害虫靶标双链RNA,通过干扰寄主昆虫必需基因的方式提供真菌的杀虫毒力,探索提高真菌杀虫毒力的新方法。东亚飞蝗F1-ATP合成酶α亚基的基因克隆及其功能研究通过序列比对及3`-RACE,从东亚飞蝗中克隆到东亚飞蝗F1-ATP合成酶α亚基(Lm-ATP5A)的cDNA序列。序列全长1888 bp,其开放阅读框长1656 bp,编码551个氨基酸。设计了Lm-ATP5A的210 bp特异片段,体外合成dsRNA,每头虫注射100 ng dsATP5A,成功降低了靶标基因的表达,降低了酶活,使胞内ATP含量降低;注射dsRNA还降低了血淋巴中血细胞数量,使血细胞中线粒体数量减少以及改变线粒体形态及膜电势;东亚飞蝗若虫和成虫在注射dsRNA后都会死亡,注射dsRNA对五龄若虫和成虫的LT50分别为2.3天、4.2天。上述结果表明:Lm-ATP5A是东亚飞蝗的必需基因,是防治东亚飞蝗的潜在靶标。表达dsATP5A绿僵菌工程菌株的构建及其毒力测定以蝗绿僵菌CQMa102为受体菌,运用根癌农杆菌介导的遗传转化技术,将ATP5A-RNAi干扰载体导入受体菌,筛选获得表达dsATP5A的转化菌株。半定量RT-PCR分析发现,dsATP5A在转基因菌株中获得成功转录。将野生菌株、工程菌株的孢子分别点滴侵染东亚飞蝗五龄若虫,工程菌株的LT50比野生型减少10.9%(p0.05);定量PCR和Western blot分析了东亚飞蝗的Lm-ATP5A基因表达,结果显示:与野生型蝗绿僵菌相比,工程菌株侵染后东亚飞蝗体内Lm-ATP5A转录和蛋白水平的表达量均明显降低;工程菌株侵染5天后,昆虫血腔中虫菌体含量为野生型的15.8倍。以上结果表明:利用昆虫病原真菌“蝗绿僵菌”能够表达东亚飞蝗的dsATP5A,表达dsATP5A的工程菌株能够干扰东亚飞蝗的Lm-ATP5A基因转录和翻译,而且能够加速在昆虫血腔内生长,从而提高其杀虫毒力。本文采用采用dsRNA和生物化学分析等方法鉴定出F1-ATP合成酶α亚基基因是东亚飞蝗的必需基因,为东亚飞蝗的防治提供了新的靶标基因及特异基因片段(dsATP5A)。利用昆虫病原真菌表达了寄主昆虫必需基因特异片段的dsRNA以干扰害虫靶标基因的表达,从而提高了病原真菌的毒力,为提高杀虫真菌菌株毒力提供了新的方法。
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S433.2;S476

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本文编号：2735973