球孢白僵菌超氧化物歧化酶与发育激活蛋白及其转录因子的的功能解析

发布时间：2017-03-29 14:08

  本文关键词：球孢白僵菌超氧化物歧化酶与发育激活蛋白及其转录因子的的功能解析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是通常缺乏有性生殖型的丝状真菌,也是重要的昆虫病原真菌,其活性成分为分生孢子的制剂被广泛用农林害虫的生物防治。昆虫病原真菌的生物防治潜能依赖于菌株的毒力和抵抗各种环境胁迫的能力即抗逆性状,因为活体菌剂田间应用后不可避免地会遭遇阳光紫外辐射、高温、干旱以及防病除草的化学农药等的多重胁迫,这些胁迫可诱导真菌细胞产生活性氧自由基(ROS)而弱化细胞功能及活力。超氧化物歧化酶(SOD)是一类非常重要的抗氧化酶类,是细胞抵抗ROS损伤的主要屏障。因此,研究SOD保护细胞免受胁迫损伤的功能及机理对生防真菌而言是很有意义的。作为孢子制剂有效成分的分生孢子产量与质量既取决于生产菌株的产孢性能及工艺的合理性,更依赖于丝状真菌中心发育通路(central developmental pathway)对孢子产量和质量的调控,而这样的调控作用在昆虫病原真菌中迄今尚无研究报道。改进生产工艺的关键是科学认识中心发育通路中各个激活蛋白及其上游转录因子是如何调控产孢与孢子成熟过程的。因此,本论文开展了两方面的研究工作,是解析了球孢白僵菌两个Cu/ZnSOD和一个FeSOD的功能,二是对中心发育通路中及其上下游调节产孢和孢子成熟的三种激活蛋白和五种转录因子开展了研究,重点揭示它们的生物学功能及可能的互作。主要结果分述如下。球孢白僵菌Cu/ZnSOD和FeSOD的抗氧化功能解析球孢白僵菌的SOD家族有五个成员,包括已研究报道的胞质MnSOD (Sod2)和线粒体MnSOD (Sod3),以及尚无研究报道的胞质Cu/ZnSOD (Sodl)、线粒体FeSOD (Sod4)和锚定孢壁的Cu/ZnSOD (Sod5).后两种SOD尽管存在于多种丝状真菌中,但很少被研究。在野生株中表达融合蛋白Sod4::eGFP和Sod5::eGFP的转基因细胞经特异性染色,证明Sod4和Sod5分别定位线粒体和分生孢子壁。将各sod敲除株或RNA干扰株与甲萘醌或H202共培养,SOD总酶活在△sodl中下降15%,在3个sod4干扰株(该基因敲除致死)中却升高11-20%,而在△sod5中较野生株无明显变化。特别的是,被RNA干扰下调约70%的sod4干扰株细胞中,过氧化氢酶(CAT)的总酶活性被降低69～75%,其降幅远大于Asodl敲除株的27～33%,而在△sod5中也无明显变化。有趣的是,4个正常Sod基因与5个CAT基因在sod4三个干扰株中的转录水平变化幅度也大于在△sod1和△sod5中的变化幅度。在对两种氧化剂的胁迫反应中,△sod1的ROS水平剧烈升高,其后依次是sod4干扰株及Δsod5敲除株。所有突变株对两种氧化剂的敏感性都表现出不同程度的升高,抵抗UV-A和UV-B辐射的能力与毒力也有不同程度的下降,但对高渗、胞壁干扰和高温胁迫的敏感性无显著变化。结合先前研究报道的Sod2和Sod3,上述结果补足了球孢白僵菌所有SOD家族成员在抗氧化、抗紫外及寄主侵染过程中角色定位的知识,揭示了SOD和CAT家族成员之间在抗氧化过程中的转录互作关系。球孢白僵菌发育激活蛋白对无性循环的调控及机理许多丝状真菌产分生孢子而扩散和生存。球孢白僵菌中BrlA、AbaA、WetA及VosA的单基因缺失,都剧烈改变其余三个基因以及上游转录调节因子(FluG和F1bB～E)的转录水平,且其转录下调90%以上的时间都发生在孢子梗发育和孢子形成期间。在正常平板培养条件下,△brlA 和△abaA不能形成任何分生孢子梗,也不形成任何气生分生孢子,在液体培养条件下也不形成单细胞芽生孢子,在两种培养条件只能以菌丝生长,不出现细胞分化现象。这说明brlA或abaA的缺失导致球孢白僵菌无性循环完全中断。△werA 和△vosA在平板上正常培养条件下分生孢子梗极为稀疏,分生孢子产量分别下降98%和88%,而且在液培条件下芽生孢子产量也也大幅下调,显示WetA和VosA都是白僵菌无性发育所必须的。菌丝细胞经特异性染色显微观察和超薄切片透射电镜观察,发现AbrlA和AabaA菌丝细胞液泡中的自噬体完全消失,AwetA细胞液泡中的自噬体则绝大部分消失,但△vosA细胞液泡中的自噬体丰度与野生株和回补株基本一致。AwetA所产分生孢子在大小、复杂度、疏水性和孢壁结构组成方面发生的损伤变化大于△vosA的分生孢子,而后者细胞中的海藻糖积累水平明显低于前者。此外,△wetA和△vosA所产分生孢子的活力、抵抗高温和UV-B紫外辐射的能力及毒力都表现不同程度的缺陷。结果表明,BrlA、AbaA和WetA通过转录互作及参与细胞自噬过程而调控球孢白僵菌的无性循环,VosA主要通过与前三者的转录互作参与产孢过程的调控。WetA和VosA都是孢子成熟所必须的,前者主要调控孢壁结构的完整性,而后者主要参与调控孢子海藻糖等抗逆相关内容物的积累。球孢白僵菌中心发育通路上游Flb族转录因子的功能解析球孢白僵菌中心发育通路上游存在四个重要转录因子F1bB、F1bC、F1bD和FlbE,与中心发育通路的激活有关。分析在正常培养期间启动无性发育关键基因brlA在各flb单基因缺失株中相对于野生株的转录水平变化,显示各flb基因缺失使brlA的转录表达发生剧烈改变。其中,brlA转录水平在ΔflbB中始终大幅下调90～99%,在△flbC中始终下调82～94%,在△flbD中下调50%左右的时间发生在产孢盛期,在ΔflbE中下调50%以上的时间也发生在产孢盛期,在此之前下调不到50%。而且,任何一个flb基因的缺失还导致其余三个flb基因在菌丝生长和孢子梗发育关键阶段的转录表达发生以下调为主的剧烈变化。这些变化说明四个Flb转录因子大多存在转录互作,因而直接或间接地激活BrlA而启动无性发育和产孢过程。四个flb缺失株表现不同程度的产孢缺陷,分生孢子产量在ΔfbC中较野生株下降达91%,在△flbE、△flbD和△flbB中分别下降42%、30%和25%。此外,四个flb缺失株还表现不同程度的多表型缺陷,包括对不同碳氮源营养的利用能力减弱,孢子萌发延迟,孢子变小及复杂度降低,孢子表面结构成分改变,对氧化、胞壁干扰、高渗及高温胁迫的敏感性升高,毒力下降。所有这些变化在各回补菌株中都恢复到野生株的水平。因此,F1bB、F1bC、F1bD和FlbE不仅直接或间接地调控BrlA的激活,还参与调控球孢白僵菌的营养利用、多胁迫应答及其对昆虫寄主的侵染。
【关键词】：昆虫病原真菌 球孢白僵菌 过氧化物歧化酶 中心发育通路 发育激活蛋白 发育相关转录因子 基因表达和调控 转录互作 细胞自噬 营养生长 分生孢子梗发育 分生孢子形成 分生孢子成熟 分生孢子质量 多胁迫应答 毒力 生物防治潜能
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S476.12
【目录】：

• 致谢6-11
• 摘要11-14
• 1 真菌超氧化物歧化酶与中心发育通路激活蛋白及其上下游转录因子的的研究现状14-23
• 1.1 生防真菌遭遇的主要环境胁迫14-15
• 1.1.1 高温14
• 1.1.2 紫外胁迫14
• 1.1.3 化学农药胁迫14-15
• 1.1.4 湿度15
• 1.1.5 氧化胁迫15
• 1.2 真菌SOD的结构与功能15-17
• 1.2.1 SOD的结构及其亚细胞定位15-16
• 1.2.2 SOD的表达与功能16-17
• 1.3 丝状真菌无性发育及其调控因子17-21
• 1.3.1 丝状真菌的无性循环17-19
• 1.3.2 丝状真菌的中心发育通路19-21
• 1.4 展望21-23
• 2 球孢白僵菌Cu/ZnSOD和FeSOD的抗氧化功能解析23-45
• 2.1 材料24
• 2.1.1 菌株和载体24
• 2.1.2 试剂及试剂盒24
• 2.2 方法24-32
• 2.2.1 真菌DNA提取25
• 2.2.2 Sod1,Sod4及Sod5的鉴定与序列分析25-26
• 2.2.3 Sod4和Sod5的亚细胞定位26-27
• 2.2.4 sod突变株的构建与鉴定27-28
• 2.2.5 SOD和过氧化氢酶(CAT)基因转录水平的检测28-29
• 2.2.6 总SOD的酶活以及总过氧化氢酶的酶活测定29-30
• 2.2.7 胞内ROS含量的测定30
• 2.2.8 生长速率、产孢量及萌发速率的检测30
• 2.2.9 化学及环境胁迫敏感性的测定30-31
• 2.2.10 分生孢子毒力的生物测定31
• 2.2.11 数据分析31-32
• 2.3 结果32-42
• 2.3.1 球孢白僵菌Sod1、Sod4和Sod5的特征32-36
• 2.3.2 sod单基因缺失或干扰改变其余sod基因的转录水平36-37
• 2.3.3 sod单基因缺失或干扰对胞内SOD总酶活及ROS水平的影响37-38
• 2.3.4 sod单基因缺失或干扰改变过氧化氢酶(CAT)的总酶活及基因转录水平38-39
• 2.3.5 sod单基因缺失或干扰对生长和产孢的影响39-40
• 2.3.6 sod突变株对化学胁迫的敏感性变化40
• 2.3.7 sod单基因缺失或干扰对生防潜能的影响40-42
• 2.4 讨论42-45
• 3 球孢白僵菌发育激活蛋白对无性发育的调控及机理45-69
• 3.1 材料46
• 3.1.1 菌株和培养条件46
• 3.1.2 试剂和试剂盒46
• 3.2 方法46-51
• 3.2.1 真菌核酸的提取46
• 3.2.2 目标基因序列的克隆和分析46-47
• 3.2.3 目标基因突变株的构建47
• 3.2.4 不同营养基质上的生长速率测定47-49
• 3.2.5 分生孢子产量及活力的测定49
• 3.2.6 孢子质量的检测49-50
• 3.2.7 菌丝自噬体、芽生孢子产量及生物量的检测50
• 3.2.8 胁迫敏感性的测定50
• 3.2.9 细胞内海藻糖含量的测定50
• 3.2.10 真菌毒力的生物测定50
• 3.2.11 发育相关基因的转录表达分析50-51
• 3.2.12 数据分析51
• 3.3 结果与分祈51-66
• 3.3.1 球孢白僵菌Br1A、AbaA、WetA和VosA的特征51-52
• 3.3.2 brlA、abaA、wetA及vosA单基因缺失或brlA过表达改变同伴基因及其上游转录因子的时空表达52-55
• 3.3.3 单基因缺失或brlA过表达改变球孢白僵菌生长发育、无性循环及毒力55-60
• 3.3.4 brlA、abaA、wetA和vosA对细胞自噬的影响60-62
• 3.3.5 brlA、abaA、wetA和vosA对细胞海藻糖积累及胁迫敏感性的影响62
• 3.3.6 brlA、wetA和vosA对孢子成熟及孢壁结构的影响62-65
• 3.3.7 brlA过表达、wetA或vosA缺失对孢子活力及孢子胁迫敏感性的影响65-66
• 3.4 讨论66-69
• 4 球孢白僵菌中心发育通路上游Flb族转录因子的功能解析69-83
• 4.1 材料69-70
• 4.1.1 菌株和培养条件69-70
• 4.1.2 试剂和试剂盒70
• 4.2 方法70-72
• 4.2.1 真菌核酸提取70
• 4.2.2 球孢白僵菌flb基因的克隆和分析70
• 4.2.3 flb单基因敲除及回补菌株的构建70
• 4.2.4 不同碳氮培养基上生长速率的测定70
• 4.2.5 分生孢子产量的测定70
• 4.2.6 分生孢子活力的测定70-71
• 4.2.7 分生孢子大小、复杂度及表面糖分子抗原表位变化的检测71
• 4.2.8 化学及环境胁迫敏感性的测定71-72
• 4.2.9 真菌毒力的生物测定72
• 4.2.10 发育相关基因的转录分析72
• 4.2.11 数据分析72
• 4.3 结果与分析72-80
• 4.3.1 球孢白僵菌FlbB-E的序列结构、同源性及转录表达特征72-74
• 4.3.2 球孢白僵菌flb单基因缺失对brlA及同伴基因转录表达的影响74-76
• 4.3.3 flb单基因缺失影响球孢白僵菌对不同碳氮源的利用76-78
• 4.3.4 flb单基因缺失对球孢白僵菌菌落形态、分生孢子产量及特征的影响78-79
• 4.3.5 flb单基因缺失对球孢白僵菌胁迫敏感性及毒力的影响79-80
• 4.4 讨论80-83
• 5 结语83-84
• 参考文献84-94
• Summary94-97
• 附录：攻读博士学位期间的主要成果97

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