丹参次生代谢相关基因SmKSL3及SmSPLs的克隆与分析

发布时间：2020-07-10 00:14

【摘要】：丹参Salvia miltiorrhiza Bunge,属唇形科(Lamiaceae)鼠尾草属(Salvia Linn),是重要的药用植物。丹参使用历史悠久,最早记录见于距今两千多年的《神农本草经》,被列为上品,用于治疗心脑血管等诸多疾病。丹参主要有效成分为:水溶性的丹酚酸类和脂溶性的丹参酮类,其中丹参酮属于二萜醌类。为了弄清丹参酮生物合成途径,本研究以丹参基因组数据为基础,经过基因克隆、基因结构分析和表达模式分析以及遗传转化等手段,对丹参次生代谢相关基因类贝壳杉烯合酶基因Sm KSL3和转录因子Sm SPL进行了研究,并利用T-DNA插入激活标签载体构建丹参突变体库以期寻找到更多与次生代谢相关的基因。基于分析和实验取得了如下的结果:1、丹参Sm KSL3基因克隆与表达调控分析在丹参基因组数据中,经过与Sm KSL1及拟南芥等模式植物的KSL基因进行同源比对,推测基因组中的一个长285bp的contig为丹参KSL基因片段,据此设计引物、运用RACE及RT-PCR技术首次克隆得到编码区全长1245bp的另一个与丹参酮合成相关的重要基因:Sm KSL3。基因结构分析表明:Sm KSL3含有5′端的非翻译区(5′UTR)208bp,在3′端有明显的poly A结构,显示出完整的基因结构,其编码区长1245bp,蛋白质分子式为C2123H3321N565O638S24,含有414个氨基酸,属疏水性不稳定蛋白。经保守域(conserve domain)、跨膜区、二级结构及立体结构等生信分析,推测Sm KSL3属于I类丹参合酶,参与催化GPP、FPP或GGPP环化形成单萜、倍半萜或二萜尤其是萜烯的合成。将序列相似度较高的9种植物KSL基因与Sm KSL1和Sm KSL3进行系统进化树分析,显示丹参Sm KSL1和Sm KSL3基因与其他物种相似的基因在遗传上都有一定距离。这些物种都不作为药用植物,据此可推知丹参作为药用植物,其有效成分、次生代谢物的生物合成可能有不同的下游途径。构建了Sm KSL1-GFP和Sm KSL3-GFP融合表达载体,用农杆菌介导转化烟草,经激光共聚焦显微镜观察其瞬时表达情况,发现Sm KSL3-GFP定位于细胞质,而Sm KSL1-GFP定位于叶绿体。基因表达模式分析显示Sm KSL1和Sm KSL3均在根中高表达,对外施茉莉酸甲酯(JA)有响应:Sm KSL1在36h时表达显著升高,Sm KSL3则在24h时显著升高。据此推测Sm KSL1和Sm KSL3均可能参与丹参次生代谢过程,并且在时间和空间上是相对独立的:Sm KSL1定位于质体,主要参与质体途径合成萜类,而Sm KSL3缺少N-端的细胞器定位信号,主要在细胞质中发挥作用。Sm KSL1和Sm KSL3在不同的时间点响应外界刺激,对生物体具有重要的生理作用。为后续深入研究Sm KSL1和Sm KSL3的功能,构建了原核表达载体,并在大肠杆菌中成功表达出蛋白质并纯化,蛋白纯度均90%。将Sm KSL3与含两个Ca MV35S强启动子的PBI121载体连接构建了Sm KSL3过表达载体。另外利用人工小RNA技术构建了Sm KSL3-artificial mi RNA敲减载体。两种载体均用农杆菌介导进行丹参的遗传转化,经初步鉴定获得过表达Sm KSL3的转基因丹参植株3株和Sm KSL3 knock-down的转基因丹参植株6株。为进一步深入研究Sm KSL3的功能、揭示Sm KSL1和Sm KSL3的功能分工奠定了坚实基础。2、丹参SmSPL转录因子的克隆与调控及功能分析SPL(SQUAMOSA promoter binding protein-likes)是植物特有的一类转录因子,在植物生长发育过程中发挥重要调控作用。通过对丹参基因组序列的分析、比对,预测出15个Sm SPL基因,随后利用RACE和RT-PCR法对它们进行了分子克隆。序列测定和分析结果表明,丹参Sm SPL具有多样化的序列特征和基因结构。丹参Sm SPL基因均含有SBP结构域,大多与两个锌指结构(CX4CX16CX2H和CX4CX16CX2C)相重合。比较分析表明丹参Sm SPL和对应的拟南芥At SPL之间具有序列的保守性。将丹参Sm SPL和拟南芥At SPL进行聚类分析,发现丹参Sm SPL可分为6个组。同一组或同一亚组内的SPL往往含有相同的motif,暗示这些SPL的功能可能是相近或冗余的。如:At SPL8与花青素和赤霉素的生物合成等有关,二者与次生代谢密切相关,而Sm SPL12与At SPL8同属一组,暗示Sm SPL12也有可能参与丹参花青素形成等次生代谢过程。另外经预测发现8个丹参SPL是mi R156/157的靶基因。用改良的5′-RACE方法验证了mi R156/157的靶基因和切割位点。丹参SPL基因在不同组织中差异表达。受mi R156/157调控的那些丹参SPL(Sm SPL2,Sm SPL3,Sm SPL5,Sm SLP6,Sm SPL8,Sm SPL11,Sm SPL14,Sm SPL15)的表达量随着丹参植株的成熟而升高,然而在此过程中,mi R156/157的表达量下降。这一方面证实了mi R156/157对Sm SPL基因的调控作用,另一方面也表明Sm SPL在丹参发育过程中发挥重要作用。此外,丹参植株成熟过程中,mi R156/157的表达与mi R172的表达呈负相关。mi R156、mi R172和SPL主要调控植物从营养生长向生殖生长过渡的时间。这种生长阶段的转变对于植物次生代谢物的积累有重大的影响。我们获得的这些结果暗示了Sm SPL、mi R156和mi R172介导的调控网络在丹参发育阶段调控中的重要性和复杂性。3、T-DNA插入激活标签突变体库的构建为了发现更多参与丹参次生代谢途径的基因,构建了兼有激活标签和基因捕获功能的T-DNA插入载体PBI-intron-GUS-4Enhancer,用此载体转化丹参建立丹参突变体库。在此过程中,除了用已报道的遗传转化方法,我们用链霉素(streptomycin)作筛选,摸索出在了在本实验体系中较易重复的丹参遗传转化体系,并获得插入突变阳性植株,其中1株具有明显表型。为发现和研究丹参次生代谢相关新基因奠定了基础。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S567.53


本文编号：2748187