稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族转录因子功能分析

发布时间：2017-03-30 23:09

  本文关键词：稻瘟病菌Zn_2Cys_6和bHLH家族转录因子功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：稻瘟病是严重危害全球水稻产量的毁灭性真菌病害,其病原物稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)由于具有典型的生活史和侵染循环,被认为是丝状真菌致病机理和真菌分子生物学的适宜研究对象,同时也是研究病原真菌-寄主植物互作的模式生物之一。了解稻瘟病菌的致病过程和机理对于促进水稻稻瘟病的防治有重要作用。水稻和稻瘟病菌全基因组测序的完成为我们提供了大量的基因组信息,从这些浩如烟海的DNA信息中揭示基因的功能以及它们在时空上有序表达的机制,是后基因组时代研究的趋势。转录因子是基因表达的调控因子,研究转录因子的生物学功能及其调控网络,对于全面了解稻瘟病菌生长发育及其在致病过程中的分子机制具有重要意义。本文主要对Zn2Cys6和bHLH家族转录因子基因在稻瘟病菌生长发育和致病过程中的作用进行系统的分析。 Zn2Cys6家族是真菌中特有的一类转录因子,也是稻瘟病菌中基因数量最多的转录因子家族。在稻瘟病菌全基因组序列中共鉴定到163个Zn2Cys6家族基因,通过高通量基因敲除方法得到104个基因的缺失突变体,系统地分析了此104个突变体在稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子产生、附着胞形成、致病性和胁迫反应等方面的作用,其中25个基因影响产孢量,GCC1、MoCOD1和CONx1三个基因的突变体几乎完全丧失产孢能力,菌丝块接种水稻及大麦叶片显示,△Mocod1完全丧失对寄主植物的侵染能力,而突变体△gcc1和△conx1仍然具有致病性；CNFl和CNF2是稻瘟病菌两个产孢的负调控因子,突变体菌株对水稻的致病性严重下降；△ccal产生畸形的分生孢子,孢子悬浮液对水稻无致病能力,但菌丝块接种离体水稻叶片仍能形成病斑,表明菌丝在寄主叶片形成的附着胞能够穿透寄主角质层而形成侵染菌丝,继而扩展表现为外部病斑。GCC1、GPF1和Gta1基因功能的缺失导致菌丝生长的缺陷,其中突变体△gpf1完全丧失对水稻的致病能力。 bHLH家族是真核生物中高度保守的一类转录因子,在稻瘟病菌全基因组序列中鉴定到9个bHLH家族基因(依次命名为MoHLH1-MoHLH9),本文对该九个基因进行了基因敲除和系统的功能分析,并着重探索MoHLH6对稻瘟病菌致病过程的调控作用。突变体△Mohlh6完全丧失了对完整和损伤宿主叶片的侵染能力；通过RFP-PTS1和GFP-PTS2共定位监测过氧化物酶体的形态和数量,发现过氧化物酶体在突变体孢子中数量较少；尼罗红染色和MoCAP20定位实验证实附着胞形成过程中脂滴由分生孢子向初生附着胞的转运和附着胞成熟过程中脂滴的降解受阻；同时发现△Mohlh6附着胞的膨压下降,而稻瘟病菌需要依赖足够的附着胞膨压才能穿透寄主表皮,因此突变体的穿透能力下降,致病能力基本丧失。通过酵母双杂交实验发现：Mohlh6与稻瘟病菌的激酶Osm1、CpkA和Mocmkk2和钙调磷酸酶的调控亚基Mocnb1存在相互作用,因此该基因可能作为cAMP信号途径、钙调途径和渗透调节途径的下游转录因子参与调控稻瘟病菌的生长发育。同时通过RNA-seq和bHLH结构域的保守DNA结合位点分析,鉴定得到Mohlh6直接调控的下游基因,并通过敲除分析了其中十个基因的功能,进一步验证了loHLH6基因在稻瘟病菌生长发育阶段的调控作用。 综上所述,本论文系统地研究了稻瘟病菌的Zn2Cys6和bHLH家族转录因子基因的功能,发现了很多对稻瘟病菌菌丝生长、分生孢子形成、附着胞发育和侵染致病等过程必不可少的基因,并详细分析了突变体AMohlh6致病性丧失的原因、转录因子MoHLH6的上游调控激酶和下游代谢基因,较为全面地阐释了MoHLH6基因的调控网络。
【关键词】：稻瘟病菌 Zn_2Cys_6家族转录因子 bHLH家族转录因子 生长发育 致病性
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.111.41
【目录】：

• 致谢6-7
• 摘要7-9
• Abstract9-14
• 第一章 文献综述14-35
• 1. 稻瘟病菌研究概况14-27
• 1.1 稻瘟病菌侵染循环15-17
• 1.2 稻瘟病菌产孢相关调控途径17-18
• 1.3 稻瘟病菌附着胞代谢及相关调控途径18-21
• 1.3.1 稻瘟病菌侵染相关发育过程的糖类代谢19-20
• 1.3.2 脂质的降解及甘油的积累20-21
• 1.4 稻瘟病菌的主要信号途径21-27
• 1.4.1 G蛋白信号途径22-23
• 1.4.2 cAMP-PKA信号途径23-24
• 1.4.3 MAPK信号途径24-26
• 1.4.4 钙调信号途径26-27
• 2. 稻瘟病菌转录因子研究概况27-33
• 2.1 锌指结构转录因子28-30
• 2.2 碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构转录因子30-31
• 2.3 同源异形盒(homoebox)结构转录因子31-32
• 2.4 bHLH结构转录因子32-33
• 3. 本研究的目的及内容33-35
• 第二章 材料与方法35-48
• 1 试验菌株及培养条件35-37
• 1.1 稻瘟病菌菌株及培养条件35
• 1.2 细菌菌株及培养条件35
• 1.3 酵母菌株及培养条件35
• 1.4 培养基配方35-37
• 2 聚合酶链反应(PCR)37
• 2.1 常规PCR37
• 2.2 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)37
• 3 质粒提取37-38
• 4 DNA操作38
• 5 遗传转化38-40
• 5.1 酵母转化方法38-39
• 5.1.1 酵母感受态细胞的制备38-39
• 5.1.2 酵母转化过程39
• 5.2 质粒大肠杆菌转化39
• 5.3 稻瘟病菌转化39-40
• 5.3.1 载体转化农杆菌(冻融法)39-40
• 5.3.2 稻瘟病菌ATMT40
• 6 稻瘟病菌RNA及DNA的提取40-42
• 6.1 稻瘟病菌RNA提取步骤40-41
• 6.2 基因组DNA小量提取(用于转化子的PCR验证)41
• 6.3 CTAB法提取基因组DNA(用于qPCR验证拷贝数)41-42
• 7 稻瘟病菌基因组DNA Southern杂交42-43
• 7.1 大量提取稻瘟病菌基因组DNA42
• 7.2 Southern杂交探针DIG标记42
• 7.3 基因组DNA酶切、电泳及变性42-43
• 7.4 DNA转膜、Southern杂交过程和免疫显色43
• 8 稻瘟病菌Western杂交43
• 8.1 稻瘟病菌总蛋白的提取43
• 8.2 稻瘟病菌核蛋白的提取43
• 8.3 SDS-PAGE电泳及Western检测43
• 9 酵母双杂交43
• 10 突变体表型分析43-45
• 10.1 不同条件下的生长速度检测44
• 10.2 产孢量测定44
• 10.3 分生孢子梗形态观察44-45
• 10.4 分生孢子萌发及附着胞分析45
• 11 稻瘟病菌致病性分析45-46
• 11.1 大麦叶片离体接种45-46
• 11.2 水稻叶片离体接种46
• 11.3 水稻喷雾接种46
• 12 稻瘟病菌植物细胞侵染观察46-47
• 12.1 大麦叶片侵染显微观察46
• 12.2 洋葱表皮细胞穿透46-47
• 13 稻瘟病菌细胞结构观察47-48
• 13.1 细胞核DAPI染色47
• 13.2 脂滴Nile Red染色47-48
• 第三章 稻瘟病菌Zn_2Cys_6转录因子的功能分析48-87
• 1 结果分析48-83
• 1.1 利用酵母同源重组原理进行高通量基因敲除48-49
• 1.2 稻瘟病菌Zn_2Cys_6转录因子的鉴定和敲除突变体的获得49-51
• 1.3 系统分析Zn_2Cys_6转录因子对稻瘟病菌不同发育阶段的影响51-63
• 1.4 影响稻瘟病菌菌丝生长和孢子产量的Zn_2Cys_6转录因子63-68
• 1.5 影响稻瘟病菌孢子萌发和附着胞形成的Zn_2Cys_6转录因子68
• 1.6 对致病性必不可少的稻瘟病菌Zn_2Cys_6转录因子68-72
• 1.7 系统分析Zn_2Cys_6转录因子对胁迫压力的反应72-78
• 1.8 RNA-seq分析突变体Δgpf1和Δcnf1表达差异基因78-83
• 2 本章讨论83-87
• 第四章 稻瘟病菌bHLH转录因子的功能分析87-115
• 1 结果分析87-112
• 1.1 稻瘟病菌bHLH转录因子的鉴定和敲除突变体的获得87
• 1.2 系统分析bHLH转录因子对稻瘟病菌不同发育阶段的影响87-93
• 1.3 稻瘟病菌中MoHLH6基因的表达分析93-94
• 1.4 Mohlh6与Osm1、CpkA、Mocnb1和Mocmkk2存在互作现象94-96
• 1.5 RNA-seq分析突变体ΔMohlh6的差异表达基因96-97
• 1.6 Mohlh6结合位点分析97-100
• 1.7 Mohlh6靶标基因功能分析100-104
• 1.8 MoHLH6与稻瘟病菌过氧化物酶体的稳定性相关104-106
• 1.9 MoHLH6的缺失影响脂滴的转运和降解106-108
• 1.10 MoHLH6和Mohlh6靶标基因影响稻瘟病菌利用非发酵型碳源108-110
• 1.11 外源葡萄糖恢复MoHLH6和Mohlh6靶标基因缺失突变体致病性缺陷110-112
• 2 本章讨论112-115
• 第五章 全文总结及展望115-117
• 1 结论115-116
• 2 后续研究工作116-117
• 参考文献117-133
• 附录133-150

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 ;A Gγ subunit promoter T-DNA insertion mutant——A1-412 of Magnaporthe grisea is defective in appressorium formation,penetration and pathogenicity[J];Chinese Science Bulletin;2006年18期

2 李海娇;卢建平;刘小红;张莉林;林福呈;;适用于稻瘟病菌基因敲除、过表达和荧光融合蛋白表达载体的构建和使用[J];农业生物技术学报;2012年01期

3 赫荣琳;樊荣辉;卢建平;林福呈;刘小红;;稻瘟菌MoCMKK2基因的功能分析(英文)[J];细胞生物学杂志;2009年04期

4 张莉林;曹慧娟;厉晓东;林福呈;冯晓晓;卢建平;;稻瘟病菌翻译调节肿瘤蛋白(MoTCTP)参与真菌生长和产孢的调控(英文)[J];中国细胞生物学学报;2013年08期

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本文编号：278298