CIRP在牦牛不同组织器官的表达及温和冷应激对细胞CIRP和HSP70表达的影响

发布时间：2020-08-27 13:31

【摘要】：在动物细胞内存在两种冷诱导RNA结合蛋白(CIRP和RBM3)。当细胞暴露于适度的冷应激及其他应激条件如:紫外线辐射、缺氧之后,这两种蛋白就会随之被诱导产生。起初学者们认为这些蛋白质对细胞增殖有抑制而非刺激作用;然而,近期学者证实CIRP具有增殖和/或原致癌基因的功能。有报道提出CIRP在小鼠原代细胞中是属于永生化基因,另外其转化作用也已经被证明,而且人类患肿瘤时,CIRP和RBM3这两个因子表达均发生上调。有学者推测CIRP可能通过抵消氧化损伤,进而参与并介导其他凋亡通路。相比于细菌和植物,目前对于哺乳动物冷休克反应的研究较少,但在某些领域例外,如适应性产热作用、耐寒性、细胞和器官的贮存等。另外,在脑损伤治疗和蛋白质合成领域,对冷应激反应的研究也相对较多。在细胞水平,一些哺乳动物细胞反应与微生物是相似的;冷应激改变细胞膜的脂质组成,并抑制蛋白质合成和细胞增殖的速率。虽然目前的研究主要涉及温度20℃以下的冷应激,但是轻度低温(25℃)就可以改变随后的细胞应答,HSP110家族的成员APG-1有明显的表现。此外,25℃应激就能诱导CIRP(冷诱导RNA结合蛋白)的表达,CIRP是哺乳动物细胞内被鉴定出的第一个冷休克蛋白质。与HSP相同的是,CIRP在37℃也表达并且可能担任一种RNA分子伴侣。哺乳动物细胞在25℃具有代谢活性,细胞可以存活,并且可以对应激刺激产生应答,因此,亚低温下哺乳动物细胞的细胞学和分子生物学研究,将可能会对医学和生物技术领域产生影响。(1)冷诱导RNA结合蛋白(cold-inducible RNA-binding protein,CIRP)调控动物机体对低温的产生相对适应性。CIRP基因在多种组织中都有表达;特别是低温、低氧及强紫外线辐射等条件都能诱导其表达。本研究选取海拔3000-5000 m的青海成年牦牛(Bos grunniens)为研究对象,利用实时荧光定量PCR、Western blot技术及免疫组化技术,提取牦牛大脑组织cDNA克隆CIRP开放阅读框(ORF),并分析CIRP的mRNA和蛋白在牦牛大脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、卵巢、睾丸及皮肤中的表达与分布水平。结果显示,CIRP mRNA序列编码区长为642bp,编码213个氨基酸,编码蛋白大小约为23kD,与家牛有较高的同源性。cirp在心脏、大脑、睾丸、皮肤高表达,肺表达量最低,这些数据可能为进一步了解及研究cirp蛋白在牦牛适应高原方面所发挥的作用提供资料。(2)冷诱导rna结合蛋白是目前哺乳动物中被广泛研究的冷应激蛋白之一。分析cirp在牦牛睾丸不同发育阶段的表达变化,探究其在牦牛睾丸发育过程中所起的作用,为进一步揭示cirp在高原哺乳动物精子发生及睾丸相关功能调节过程中的作用机制提供理论依据。实验采用实时荧光定量rt-pcr(qrt-pcr)、westernblot及免疫组织化学sabc法检测1日龄、5月龄、1岁及3岁牦牛睾丸cirpmrna及蛋白的表达。rt-pcr反应扩增得到牦牛cirpmrna序列编码区长为642bp,编码213个氨基酸,编码蛋白大小约为23kd,与家牛有较高的同源性。实时荧光定量rt-pcr和westernblot实验结果显示,cirpmrna及蛋白在各年龄牦牛睾丸中均有表达,且随着年龄的增长,表达呈现上升趋势。免疫组织化学结果显示,1日龄牦牛睾丸曲细精管上皮中可观察到较弱的免疫阳性反应,阳性细胞为精原细胞;5月龄曲细精管上皮cirp表达较丰富,阳性细胞仍为精原细胞;1岁曲细精管上皮出现初级精母细胞,并与精原细胞表达阳性;3岁牦牛睾丸发育成熟,曲细精管表达强烈,阳性细胞为精原细胞和初级精母细胞且主要位于细胞核内。综上所述,牦牛睾丸中cirp表达量随年龄增长而变高,这提示cirp可能对牦牛睾丸发育及生精细胞的增殖分化具有调控和保护作用。(3)细胞冷应激反应是一个复杂的过程,它包括低温本身的应激阶段和复温后的应激阶段,本研究以牦牛卵泡颗粒细胞为研究对象,利用实时荧光定量pcr、westernblot技术,分析温和冷处理(25℃)1d、5d及复温1、2、4、8及24h条件下,细胞内cirp、hsp70及p53变化规律。结果显示,细胞在25℃培养5d,然后通过复温至37℃,会影响细胞生理状态以及诱导细胞应激反应。cirp的表达量在25℃温和冷处理第1天开始上升,并且在复温后24h左右恢复到正常水平。hsp70的表达量在37℃复温培养后逐步上升,复温8h出现峰值,随后下降。p53mrna表达水平在复温培养4h出现峰值,随后下降,并且在cirp及hsp70mrna高表达时,均有明显的下降。结果表明,低温会诱导细胞cirpmrna和蛋白表达水平的上升;hsp70能够被冷应激后的复温诱导;cirp和hsp70都具有抗应激损害和细胞凋亡的作用。这些数据将为亚低温和复温应激在各种研究和治疗领域的应用提供参考。
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S823.85

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