苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒ac130（gp16）和ac132的功能研究

发布时间：2020-09-10 19:04

　　 苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus, AcMNPV) orf130 (ac130, gp16)和orf132 (ac132)位于该基因组上由五个同向基因形成的基因簇中(orf129-133)。ac130编码一个分子量为16kDa的糖蛋白。其同源基因存在于所有已完成测序的I组和大多数II组α-杆状病毒中。ac132的同源基因存在于所有已完成测序的I组α-杆状病毒中。这两个基因在杆状病毒复制周期中的作用尚未明了。本文对ac130和ac132及其编码的蛋白质的分子生物学特征和在病毒复制中的功能进行了研究分析。利用λ-Red同源重组系统和Bac-to-Bac系统从AcMNPV基因组敲除gp16,获得gp16缺失突变体并构建gp16异位回复突变体。分别用gp16缺失、缺失回复突变体和野生型病毒转染和感染Sf9细胞,比较分析gp16缺失突变体病毒在培养细胞中的复制特征和表型变化。实验结果显示,gp16缺失突变体在受感染细胞中的增殖曲线和芽殖型病毒体(budded virus, BV)产量与gp16回复突变体和野生型病毒没有显著差异。对分别被gp16缺失、回复突变体和野生型病毒感染的细胞在不同时间点取样进行Real-time PCR分析的实验结果表明,gp16缺失对病毒基因组DNA复制没有影响。利用AcMNPV VP39和多角体蛋白特异性抗体,对gp16缺失和回复突变体病毒感染细胞的蛋白进行SDS-PAGE和western-blot分析的实验结果显示,两种病毒感染细胞在各个对应时间点的蛋白质样品中的VP39和多角体蛋白表达量无显著差异,表明gp16缺失对晚期基因表达没有显著影响。对gpl6缺失和回复突变体病毒感染Sf9细胞的超薄切片电子显微镜观察结果表明,gp16缺失突变体在受感染细胞中的形态发生过程与野生型和缺失回复突变体相似。这些实验结果表明,gp16是病毒复制非必需基因。用gp16缺失突变体、gp16回复突变体和野生型病毒包涵体感染甜菜夜蛾三龄幼虫的生物测定实验结果显示,gp16缺失突变体病毒的半数致死剂量与野生型和gp16回复突变体病毒没有显著差异,但半数生存时间比野生型和gp16回复突变体延长至少6h。据早期研究报道,黄杉毒蛾核多角体病毒(Orgyia Pseudotsugata multiple nucleopolyhedrovirus, OpMNPV) GP16定位于受感染细胞核膜周围的片层膜状结构。在本研究中,我们构建了gp16启动子控制的表达GP16-EGFP融合蛋白的重组病毒对GP16进行亚细胞定位分析。激光共聚焦显微镜观察显示,GP16-EGFP融合蛋白在受感染的Sf9细胞中聚集于靠近核膜周围。在AcMNPV感染Sf9细胞的亚细胞组分分离实验中,GP16蛋白存在于细胞质的轻膜部分。对受感染细胞超薄切片的电镜观察显示,子代核衣壳穿过核膜时形成许多跨越核膜并包裹核衣壳的囊泡。综合上述实验结果,推测GP16可能定位于受感染细胞的高尔基体,参与核衣壳的出核和/或在细胞质中的转运过程。同样利用λ-Red重组系统和Bac-to-Bac系统分别构建敲除orf129-132以及单独敲除ac132的AcMNPV突变体。鉴于以往的研究报道和本文的前述研究结果显示orf129、orf131和即16对病毒复制是非必需的,我们分别在orf129-132缺失和ac132单独缺失突变体的基础上构建了ac132异位回复突变体,研究ac132对病毒复制的作用。转染和感染实验结果显示,用orfl29-132缺失和ac132单独缺失突变体bacmids转染的细胞培养上清液接种的新细胞培养中只出现个别被感染的细胞；而两种ac132回复突变体bacmids均能在被转染细胞中复制出感染性病毒；所产生的子代病毒的生长曲线与野生型病毒生长曲线相似。此结果表明ac132对病毒正常复制是必需的。利用AcMNPV VP39和E25蛋白特异性抗体,对ac132缺失和回复突变体bacmids转染细胞的蛋白质进行SDS-PAGE和western-blot分析的实验结果显示,两种bacmids转染细胞在各个对应时间点的蛋白质样品中的VP39和E25表达量无显著差异,表明ac132缺失对晚期基因表达没有显著影响。ac132缺失突变体和缺失回复突变体转染细胞的超薄切片电镜照片显示,ac132缺失突变体转染的细胞核中病毒发生基质和包涵体出现的时间较缺失回复突变体转染细胞延迟；有囊膜的核衣壳数量减少；包涵体中的病毒粒子主要以单粒包埋为主。从AcMNPV感染的细胞培养上清液和细胞裂解物分别纯化BV和病毒包涵体,从包涵体中纯化多角体源性病毒体(occlusion-derived virus, ODV),分别从BV和ODV分离囊膜和核衣壳组分。对BV和ODV囊膜和核衣壳组分的SDS-PAGE和western-blot分析结果显示,AC132同时存在于BV和ODV核衣壳组分,未见于囊膜组分；表明AC132是BV和ODV共有的核衣壳蛋白。从病毒体组分中检测到的AC132大小约28kDa。利用SDS-PAGE和western-blot分析AC132在受感染细胞中的表达时程的实验结果显示,AC132条带最早见于感染后12h的细胞裂解物中,在感染细胞后24h的细胞中达到最大量。对AcMNPV感染的Sf9细胞的免疫荧光-共聚焦显微镜实验分析结果显示AC132最早见于病毒感染后12h,主要分布在细胞质中,也有极少量以斑点状存在于细胞核中心区；在24h时,主要分布在细胞核中,在细胞核的边缘呈环形分布；在72h时,仅见于细胞核中。为了进一步探究AC132影响病毒复制的作用机制,利用AcMNPV AC132、VP39、39K、 ODV-E18和P6.9的特异性抗体对AcMNPV感染的Sf9细胞裂解物进行免疫共沉淀实验分析。实验结果显示,AcMNPV囊膜蛋白ODV-E18和唯一的病毒DNA结合蛋白P6.9分别与AC132一起被AC132抗体沉淀。由此推测,AC132可能通过与P6.9的作用参与核衣壳的组装；通过与ODV-E18的相互作用影响核衣壳获得囊膜的过程。
【学位单位】：华中师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S476.13

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本文编号：2816198