不同遗传类型噬菌体对产志贺毒素大肠杆菌0157:H7的灭菌效果以及产生遗传变异的影响

发布时间：2020-09-18 15:37

　　在畜牧业生产中,抗生素常以饲料添加剂或治疗用药的方式饲喂动物,从而达到促进动物生长和治疗疾病的目的。然而,耐药菌的出现和抗生素在畜产品以及环境中的残留已成为全球性的卫生问题。近年来,肉制品加工厂采取了一系列措施来控制危害人类健康的食源性致病菌——大肠杆菌0157:H7(Escherichia coli O157:H7)进入食物链,但因误食受该菌污染牛肉制品而致病的现象仍时有发生。显然,寻找一种更有效的控制牛肉污染大肠杆菌O157：H7的方法势在必行。本论文主要研究了四种遗传类型噬菌体(T5,T1,T4和rV5)对牛肉污染大肠杆菌O157：H7的灭菌效果及其遗传变异的影响,并考察了核酸染料叠氮溴化丙锭(PMA)联用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术准确评价噬菌体杀菌效果的可行性,探讨和评价在牛肉加工生产中应用噬菌体生物防控策略的可能性,为保障食品安全创建一个有效的生物防治平台。实验首先以大肠杆菌O157：H7 O抗原翻转酶基因(O-antigen flippase, wzx)为指示基因,应用PMA-qPCR方法检测噬菌体T5-like(AKFV33).T1-like (AHP24)、T4-like(V7)和rV5-like(AHP24S)对大肠杆菌0157:H7 R508N的灭菌效果,以及对大肠杆菌O157：H7基因组DNA的降解情况。结果显示,100μM PMA能完全结合热灭活大肠杆菌O15:H7 DNA(7log10CFU),而不影响存活菌DNA的扩增。病原菌经4株噬菌体侵染后,存活菌的PMA-qPCR检测结果显著高于传统平板计数法；且四株噬菌体对宿主DNA的降解程度差异显著(P0.01)。本实验首次将PMA-qPCR成功应用于噬菌体灭菌效果的检测,并将检测时间由传统的48h缩短为5h。实验模拟实际牛肉生产条件,检测上述四种噬菌体分别在4℃、22℃和口37℃环境下对牛肉表面污染五株萘啶酸抗性大肠杆菌0157:H7(E318N, E32511,H4420N,R508N,C0281-31N)的灭菌效果,并成功应用杀病毒剂(10mM FeSO4+15% Tea)提高检测准确性。结果如下：首先,不同噬菌体灭菌效果差异显著(P0.001)。AKFV33在三个温度下都呈现出最强的灭菌能力,最高灭菌率达99%,其次是AHP24和V7,而AHP24S灭菌效果最差。其次,温度显著影响噬菌体灭菌效果(P0.01)。4℃环境下,噬菌体杀菌效果最差(平均灭菌量为3.log10CFU/cm2);而在37℃时,噬菌体对大肠杆菌O157：H7的灭菌效果达到最高(平均灭菌量为3.2log10CFU/cm2),因此噬菌体对大肠杆菌O157:H7的灭菌效果随着温度的升高而显著增强。第三,作用时间显著影响噬菌体灭菌效果(P0.001)。随着噬菌体作用时间的延长,其杀菌能力明显提高。例如,在冷藏温度(4℃)环境下,噬菌体对大肠杆菌的灭菌量在144h达到与37℃ 3h相当的灭菌效果,最高为3.21og10CFU/cm2。随后,采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型技术对在牛肉灭菌实验中存活的120株大肠杆菌O157：H7的基因变异情况和亲缘关系进行了研究,并且通过微孔板分析法检测了存活菌株(5株突变型和115株野生型)对四株噬菌体的易感性。PFGE结果表明五株同浓度大肠杆菌O157：H7混合液,经四种同滴度噬菌体侵染后,存活菌株在概率上存在显著差异。菌株E318N对四株噬菌体最易感,其次是E32511,而噬菌体对H4420N的灭菌效果最差。实验检出的5株突变菌株分别产生于AFKV33 (4/5)和V7(1/5)处理组,AHP24和AHP24S实验组均未出现突变菌株(0/5),说明高裂解性噬菌体更易使宿主菌发生突变。然而,尽管部分大肠杆菌O157：H7产生了基因突变菌株,但噬菌体仍对其易感。综上,本论文首次成功地将PMA-qPCR方法应用于对噬菌体灭菌效果的准确检测,证明了噬菌体有效控制牛肉污染大肠杆菌0157:H7的可行性,初步揭示了不同遗传类型噬菌体对大肠杆菌O157：H7产生基因突变的影响,为噬菌体筛选和牛肉灭菌策略的商业化实施提供了可靠的事实依据和理论支持。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.6
【部分图文】：

示意图,生活周期,菌体,示意图

物质从及外壳蛋白的合成；（４）装配，将合成产物组装成新的病毒粒子；（５）逡逑裂解与释放，嗟菌体裂解细菌，释放子代枿菌体，开始新的溶菌周期。生活逡逑周期见图１。Ｔ５作为枿菌体中研究较为清楚的一种

不同遗传类型噬菌体对产志贺毒素大肠杆菌0157:H7的灭菌效果以及产生遗传变异的影响

图４邋ＰＭＡ结合巧苗ＤＮＡ逡逑Ｆｉｇ．４邋Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ＤＮＡ邋ｂｙ邋ＰＭＡ逡逑

灭菌效果,菌体,宿主

２．邋４．邋８隘菌体对宿主ＤＮＡ的降解逡逑理论上，ｎｏｎ－ＰＭＡ－ｑＰＣＲ结果为存活菌和死菌的总和，应接近接种量，但逡逑实际检测结果却比接种量下降了邋１？２１ｏｇｉ，，ＣＦＵ邋（图１１），表明唆菌体在裂解逡逑细菌的同时，可能将部分细菌的ＤＮＡ裂解，且降解位点位于（ＴＺＸ基因，阻断逡逑了该基因扩增。从图中可Ｗ看出，唆菌体对宿主ＤＮＡ邋（确切的说是基因）逡逑的降解程度差异显著，表现为ＡＨＰ２４＞ＡＦＫＶ３３（／Ｘ０．邋０１）〉ＡＨＰ２４Ｓ＞Ｖ７（b6＜０．０１）。逡逑２．邋５讨论逡逑２．５．邋１关于实验设计的讨论逡逑近年来，随着抗生素的广泛使用，细菌抗药性问题层出不穷，科学家们逡逑再次将病原茵的治疗转向隆茵体，因此，作为实践应用的前提，评价和筛选逡逑高效枿菌体成为当务之急。传统的评价幢菌体灭菌效果的平板计数法不能有逡逑

【参考文献】