小孢子培养结合诱变处理创制大白菜突变体及其功能基因组学研究

发布时间：2020-10-16 13:42

　　 大白菜(Brassica campestris ssp. pekinensis (Lour) Olsson)属于十字花科芸薹属A基因组,是我国广泛栽培的重要蔬菜作物。随着大白菜基因组序列信息的释放,其基因组学研究进入了功能基因组时代。鉴于突变体是植物功能基因组学研究的理想材料,本项研究以大白菜小孢子DH系‘FT’为试材,将游离小孢子培养技术与人工诱变相结合,建立了一种快速创制纯合突变体的新方法；以创制的大白菜突变体为试材,利用分子标记、基因定位以及转录组测序等方法,开展功能基因组学研究。主要研究结果如下：1.游离小孢子培养结合60Co-γ射线诱变处理,快速创制出5份大白菜纯合突变体用60Co-γ射线(20、40、60 Gy)诱变处理小孢子发育处于单核靠边期的花蕾,再从花蕾中分离小孢子进行培养,在获得的1,483株小孢子再生植株中,鉴定出467株变异植株。经M1代鉴定,筛选出5份突变体材料,突变率为0.34%。与野生型DH系'FT’相比,突变体材料分别表现出花瓣退化、生育迟缓、雄性不育、叶片黄化和不结球等特征性状。2.游离小孢子培养结合EMS(甲基磺酸乙酯)诱变处理,快速创制出7份大白菜纯合突变体用EMS (0.04%,0.08%,0.12%)诱变处理分离纯化后的小孢子,再进行小孢子培养,获得1,304株小孢子再生植株。经Mo和M1代鉴定,筛选出7份突变体材料,突变率为0.46%。与野生型DH系‘FT’相比,突变体材料分别表现出雌性不育、早抽薹、生长缓慢、叶片黄化和叶球变长等特征性状。3.利用分子标记和RNA-Seq技术,对花瓣退化突变基因pdm进行精细定位和候选基因预测花瓣退化突变体pdm的表现特征是花瓣皱缩不开展。遗传分析结果表明,该突变性状由一对隐性核基因控制。构建F2分离群体,选取1,419株表现突变性状的隐性纯合体作为定位群体,将突变基因pdm定位在A01染色体的Indelhsn26和SSRhsn123两个标记之间,遗传距离各为0.04 cM,物理距离约为285.2 kb。经与大白菜参考基因组序列比对,在目标区域内共有28个基因。基于野生型‘FT’与突变体pdm的比较转录组分析,预测Bra040093为突变基因pdm的候选基因.Bra040093编码过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(ACX1),参与茉莉酸生物合成。该基因在野生型‘FT’与突变体pdm之间有2个SNPs差异。qRT-PCR分析结果表明,Bra040093在野生型'FT’中的表达量显著高于突变体pdm。4.利用RNA-Seq技术,筛选到与生育迟缓突变体drm表型相关的差异表达基因生育迟缓突变体drm的表现特征是生长发育缓慢,叶球较小,苗期伴有轻度的叶片黄化。遗传分析结果表明,该突变性状由一对隐性核基因控制。与野生型‘FT’相比,突变体drm叶片的叶绿素含量明显降低、叶绿体结构异常、光合速率下降、叶绿素荧光动力学参数发生变化。利用RNA-Seq技术,对野生型‘FT’与突变体drm的叶片进行比较转录组分析,共检测到338个差异表达基因。经GO和KEGG pathway分析,筛选到一些参与叶绿素降解和光合作用的差异表达基因,包括叶绿素酶(chlorophyllase)和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase; Rubisco)。选取与叶绿素降解和光合作用相关的差异表达基因进行qRT-PCR分析,推测突变基因drm可能阻碍了叶绿素生物合成和叶绿体发育,进而影响植株的生长和发育。5.利用RNA-Seq技术,筛选到与雌性不育突变体fsm表型相关的差异表达基因雌性不育突变体fsm的表现特征是雌蕊败育,但是雄蕊正常可育,其它花器官表型也发生了较大变异。遗传分析结果表明,该突变性状由一对隐性核基因控制。与野生型‘FT’相比,突变体fsm的胚珠发育异常。利用RNA-Seq技术,对野生型‘FT’和突变体fsm的花蕾进行比较转录组分析,共检测到1,872个差异表达基因。经GO和KEGG pathway分析,筛选到一些参与胚珠发育的差异表达基因,包括PRETTY FEW SEEDS 2 (PFS2)和温度诱导的脂质运载蛋白(temperature-induced lipocalin; TIL),同时鉴定出多个与花发育和开花相关的基因。利用qRT-PCR技术,分析了其中的18个差异表达基因的表达模式,包括2个与胚珠发育相关的基因和16个与花发育和开花相关的基因,推测突变基因fsm可能影响了胚珠的发育,使之不能完成正常的受精过程。
【学位单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S634.1
【部分图文】：

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本文编号：2843333