表达猪源GM-CSF或IL-4的重组猪繁殖与呼吸综合征病毒的构建及其免疫效率评价

发布时间：2020-10-23 18:25

　　 猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是危害世界养猪业的重要病毒性传染病之一。世界动物卫生组织(OIE)将其列为B类法定报告动物疫病,我国将其列为二类动物疫病。该病的病原是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),动脉炎病毒科成员。PRRSV是有囊膜的单股正链RNA病毒,具有广泛的基因多样性和高度的变异性。PRRSV感染后抑制机体的先天性免疫应答,并且诱导中和抗体的水平低,给该病的防控带来了严峻的挑战。目前PRRS预防主要依靠弱毒疫苗的免疫接种,但在现地,由于种种原因,免疫失败时有发生,因而开发新的PRRS防治策略很有必要。本研究以PRRSV弱毒苗(CH-1R)感染性克隆为载体,首先构建不同Body TRS启动表达EGFP的重组病毒,以此为模型比较不同Body TRS表达外源基因的效率;在此基础上构建Body TRS6启动表达猪粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(pGM-CSF)或/和猪白细胞介素-4(pIL-4)的重组PRRSV;在猪体内进行免疫保护攻毒实验,比较重组病毒与亲本毒株的免疫效率。取得的成果如下:1构建在PRRSV基因组N基因和3’-UTR之间由不同Body TRS启动表达EGFP的重组感染性克隆,转染Marc-145细胞后,可以拯救出病毒。病毒生物学特性分析表明,重组病毒的生长特性与亲本毒株相似。初步比较不同Body TRS启动表达EGFP的效率表明,Body TRS6的效率最高,其次为Body TRS2/5/7,Body TRS3/4启动表达EGFP的效率最低。遗传稳定性结果显示,重组病毒至少可以在Marc-145细胞上稳定传至5代以上。2构建在PRRSV基因组N基因和3’-UTR之间插入由Body TRS6启动表达pGM-CSF或/和pIL-4的重组感染性克隆,转染Marc-145细胞后,可以拯救出病毒。病毒生物学特性分析表明,重组病毒的生长特性与亲本毒株相似。遗传稳定性分析表明,单独表达pGM-CSF的重组病毒在Marc-145细胞上至少可以稳定传至10代以上,并且具有良好的刺激骨髓细胞增殖的能力。单独表达pIL-4的重组病毒至少可以稳定传至15代以上,而同时表达这两种细胞因子的重组病毒在传至第3代或者第5代时,目的基因已经逐渐丢失。3运用免疫保护攻毒实验研究重组病毒CH-1R/pGM-CSF的免疫效率,结果显示CH-1R/pGM-CSF诱导猪体产生了与CH-1R相似的体液免疫水平。细胞免疫方面,与CH-1R相比,CH-1R/pGM-CSF在攻毒当天以及攻毒后第7天,在外周血中诱导出更高比例的CD4+CD8+T细胞以及高水平的IFN-γ,攻毒后21天的病毒血症也明显降低,同时体温升高的幅度也低于CH-1R。以上结果表明,CH-1R/pGM-CSF可以诱导出比CH-1R更高的细胞免疫水平,同时可以降低HP-PRRSV在猪体内的持续性感染。4运用免疫保护攻毒实验研究重组病毒CH-1R/pIL-4的免疫效率,结果显示重组病毒具有与亲本毒株CH-1R相似的诱导体液免疫应答的能力。细胞免疫方面,与CH-1R相比,CH-1R/pIL-4免疫组在攻毒后第3天和第7天在外周血中诱导出更高比例的CD4+CD8+T细胞,同时CH-1R/pIL-4免疫组在攻毒后第7天血清中IL-4的水平显著高于CH-1R免疫组,但攻毒后这2个实验组之间病毒血症,体温变化以及临床表现都没有显著差异。以上结果表明,CH-1R/pIL-4没有显著提高疫苗的保护效率。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S852.65
【部分图文】：

.1 吸附和进入PRRSV 在较低 PH 值条件下进入细胞，整个过程是通过标准的内吞方auwynck et al. 1999)。敲除网格蛋白（Clathrin）的重链抑制了 EAV 的感染，示动脉炎病毒颗粒都包含有一个被网格蛋白包裹的相对较小的结构(Nits08; Snijder et al. 1998)

leader TRS hairpin”(LTH)在转录中也发挥着重要角色(van den Born et al. 2004)。PRNA 合成示意图见 1-2。

不同BodyTRS启动EGFP表达的重组PRRSV感染性克隆结构示意图
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本文编号：2853385