基于MeRIP-seq的水稻RNA m6A甲基化修饰的研究

发布时间：2020-10-26 00:14

　　 RNA酶促共价研究,尤其是6-甲基腺嘌呤(m6A),开启了RNA生物学研究的一个新领域。m6A修饰是真核生物mRNA内部序列中最常见的一种转录后修饰形式,是一个由甲基化酶复合物(METTL3, METTL14, WTAP等)和去甲基化酶(FTO, ALKBH5等)共同调控的动态可逆过程,主要发生在RRACH (R=purine, H=A, C或U)的保守基序上,但不能排除其他基序的存在。RNA m6A转录后修饰具有重要的功能,而特定的"reader"蛋白可以专一识别并引导它们行使相应的功能,包括影响mRNA的出核、转运、翻译、降解和可变剪切等。高通量测序技术结合免疫沉淀方法的MeRIP-seq (m6A-seq)技术使全基因组范围内深入地研究m6A的分布和功能等变得可行,然而用于分析大规模m6A测序数据的方法和软件相对匮乏。鉴于此,本论文的研究内容主要包括两个方面：一是首次研究并开发了简单易用的m6A测序数据分析软件包MeRIP-PF;二是采用MeRIP-PF技术,首次开展了水稻多组织RNA m6A修饰谱的绘制与比较研究。MeRIP-PF是一款专门针对MeRIP-seq数据,快速鉴定m6A修饰区域的数据分析软件,其基本原理是通过比较对照样品和IP样品测序数据在基因组/转录本上的分布,经统计检验,鉴定m6A的修饰区域,具体为首先将对照和IP样品的测序数据比对到参考基因组上,并统计每个分割窗口(Bin=25bp)的读段数；然后通过比较每个窗口读段数的分布计算显著性差异的p值和FDR值：最后,FDR≤0.05作为区分可信的m6A修饰区域与背景区域的判定值。MeRIP-PF还提供了基因层次和peak层次的注释信息,主要包括peak的大小、位置、甲基化程度等,同时对部分结果进行了图示化展示,如所有peak在转录组水平的分布特征、测序读段在基因各个注释位置的分布特征、单个修饰基因peak的展示以及peak的甲基化程度与基因表达丰度的相关性。MeRIP-PF采用Perl语言编写,已发布在http://software.big.ac.cn/MeRIP-PF.html网站,用户可免费下载使用。借助MeRIP-seq技术,我们首次开展了水稻不同组织(愈伤组织、叶片组织以及4个不同萌发时间点的种胚)RNA m6A甲基化修饰谱的比较研究。首先,分别从mRNA、基因和染色体水平揭示了水稻m6A修饰的分布特征：(1)m6A在mRNA上的分布与哺乳动物(如人、小鼠等)类似,主要分布在CDS区和3’UTR区；(2) m6A peak在单个基因上的分布存在较大差异,平均每个基因携带两个m6A修饰位点,关联分析显示基因上peak的不等分布与修饰基因的基因结构特征(外显子数目、基因全长和内含子长度等)及基因表达水平相关；(3) m6A peak倾向于分布在染色体两端的端粒区,而越靠近着丝粒区peak密度越低,即呈现一个"2-terminal hot"的分布特征,此外,m6A peak在不同染色体上的分布密度也不尽相同,我们推测其密度可能与染色质的状态和构象密切相关。其次,通过比较水稻愈伤组织和叶片组织的m6A修饰谱,分别发现了626和5,509个SMGs(Selectively m6A-Modified Gene)并探索了可能的机制。功能分析发现两个组织的SMGs分别主要富集在转录调控相关的功能类和与光合作用密切相关的功能类中。进一步与已知RBP结合motif的比较发现,叶片组织的SMGs中富集的保守序列UGUAMM (M=A|C),与PUM蛋白结合RNA的基序非常类似,而水稻基因组中6个PUM家族基因在叶片组织中呈现全部下调或者接近不表达的状态。据此我们提出了竞争结合的模型,即细胞中某些RBP(如PUM)的表达会阻碍甲基化酶与RNA的结合从而阻碍m6A修饰的生成,而相反如果这些RBP在某一特定组织或某一组织的特定时期中为极低表达或不表达状态,m6A甲基化酶就可以在无阻力的情况下进入甲基化修饰的区域行使功能,从而造成了这些特定组织或特定时期样品中选择性甲基化基因的出现。最后,我们在不同萌发时间点种胚的转录组和甲基化组数据的分析中发现,众多萌发早期关键调控基因(激素类代谢相关的基因、贮藏蛋白、LEA蛋白等)的m6A水平都发生了显著变化,提示m6A可能参与水稻早期萌发过程的调控。综上所述,本研究工作中我们首次研发了简单易用的m6A测序数据分析流程包MeRIP-PF,用于快速分析大规模m6A测序数据,并采用MeRIP-seq测序技术,开展了水稻多组织RNA m6A修饰谱的比较研究,弥补了m6A在植物尤其是水稻中的研究空白,为水稻的RNA表观修饰研究奠定了基础。
【学位单位】：中国科学院北京基因组研究所
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S511
【文章目录】：
致谢
摘要
ABSTRACT
专业词汇中英文对照表
1 引言
    1.1 RNA修饰
    1.2 m6A的发现及研究历程
        1.2.1 m6A的发现
        1.2.2 m6A研究的里程碑事件
    1.3 m6A甲基化/去甲基化及修饰后的调节
        1.3.1 m6A甲基化/去甲基化的动态可逆过程
        1.3.2 METTL3
        1.3.3 其他相关基因的研究
    1.4 m6A分布特点及motif研究
        1.4.1 m6A的组织分布特点
        1.4.2 m6A的基因组分布特点
        1.4.3 m6A保守序列的研究
    1.5 m6A生物学功能
    1.6 m6A检测方法及IP-seq技术概述
        1.6.1 MeRIP-seq技术的实验原理
        1.6.2 MeRIP-seq技术的数据分析方法
        1.6.3 单核苷酸分辨率定量检测m6A水平
    1.7 调控种子早期萌发相关基因与机制的研究概述
        1.7.1 种子萌发
        1.7.2 调控种子早期发育的相关基因与机制的概述
    1.8 研究内容与研究意义
2 材料与方法
    2.1 实验样品
    2.2 实验试剂与耗材
    2.3 MeRIP-seq实验方法
        2.3.1 RNA-seq文库构建
6A抗体的免疫沉淀反应'>        2.3.2 基于抗m⁶A抗体的免疫沉淀反应
    2.4 数据分析方法
        2.4.1 原始数据的质量评估及预处理
        2.4.2 有效测序数据的序列比对
        2.4.3 基因定量、差异表达分析及聚类分析
        2.4.4 特定基因的功能分析
        2.4.5 m6A peak的定量及差异分析
        2.4.6 m6A保守序列的搜索与鉴定
3 结果与讨论
    3.1 甲基化区域的鉴定方法--MeRIP-PF的研发
        3.1.1 MeRIP-PF方法的原理
        3.1.2 MeRIP-PF性能测试
        3.1.3 MeRIP-PF与最新方法的比较
    3.2 水稻m6A甲基化修饰谱的基本特征
        3.2.1 6个样品的测序数据（IP+Input）的基本情况
        3.2.2 水稻中m6A peak的鉴定
        3.2.3 水稻中m6A peak的分布特征
        3.2.4 m6A peak与基因特征、基因表达的关系
    3.3 SMG的鉴定及其机制的探索
        3.3.1 SMG的定义
        3.3.2 SMG的鉴定与功能分析
        3.3.3 SMG相关机制的探索
    3.4 水稻种子萌发早期基因表达与m6A修饰的关系
        3.4.1 种子萌发早期的共表达基因的聚类分析
        3.4.2 共表达基因的功能分析
        3.4.3 种子萌发早期重要调控基因m6A的动态变化
4 结论
参考文献
附录A
附录B
作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果

【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 李语丽;于军;宋述慧;;RNA中6-甲基腺嘌呤的研究进展[J];遗传;2013年12期

2 Yuli Li;Shuhui Song;Cuiping Li;Jun Yu;;MeRIP-PF:An Easy-to-use Pipeline for High-resolution Peak-finding in MeRIP-Seq Data[J];Genomics, Proteomics & Bioinformatics;2013年01期

本文编号：2856184