BmCPV编码的microRNA鉴定及其RDRP基因的dsRNA干扰研究

发布时间：2020-10-29 22:08

　　 家蚕质型多角体病毒(Bombyx mori Cytoplasmic polyhedrosis virus,BmCPV)病,是家蚕的一种肠道型病毒病,在养蚕生产上具有较大的危害性,病原是一种具包涵体的多角体病毒。研究家蚕质型多角体病毒编码的microRNA(miRNA)和RNA干涉(RNA Interfering,RNAi),一方面从miRNA途径探明病毒与宿主的免疫调控关系,从而找到miRNAs调控病毒的靶点;另一方面探索RNAi干扰病毒复制的可行性,对于家蚕病毒病的分子治疗乃至抗病品种的育成具有重要的理论和实际意义。本研究预测了BmCPV编码的miRNAs,对其中的两条进行了生物信息学分析、鉴定和表达特征检测,初步探索了对病毒本身基因表达的影响;同时研究了双链短RNA(简称dsRNA)对BmCPV-RDRP基因的干扰作用,构建了表达dsRNA的转基因载体。通过本文研究,为进一步探索miRNAs与家蚕基因组互作的关系,miRNAs影响宿主的基因的表达,miRNAs与BmCPV病毒各分节基因相互作用的细致研究等提供重要的参考价值,同时也为培育抗BmCPV家蚕品种提供了技术依据。现将研究汇报如下。1.BmCPV能够编码miRNAs。对感染BmCPV的家蚕中肠组织提取总小RNA,通过深度测序建立了小RNA文库,预测获得BmCPV编码的miRNAs。对其中的两条miRNAs进行生物信息学分析、验证和表达特征检测。表明两条miRNA分别为BmCPV基因组RNA第三片段编码的miR-3(478~497 bp)和第五片段编码的miR-5(2481~2500bp),大小均为20 bp;在线分析绘制了其二级结构和3-D结构;Stem-loop RT-qPCR和Northern blot两种方法验证,确认了两条miRNAs的存在;表达特征检测进一步表明,miR-3表达量相对较多而miR-5表达较少,家蚕感染BmCPV 5 h后能检测到病毒编码的miRNAs,24 h后表达量呈上升趋势。研究结果表明BmCPV能够编码miRNA,为进一步深入研究BmCPV编码的miRNAs及其功能奠定了基础。2.BmCPV编码的miRNAs对病毒本身基因表达具有调控作用。家蚕感染病毒后体腔注射过量miR和Inhibition-miR,RT-qPCR检测病毒基因表达,结果显示,过量miR能够显著促进病毒部分基因表达。3.dsRNA对BmCPV-RDRP基因的干扰作用。以家蚕质型多角体病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(BmCPV-RDRP)基因为靶标,设计合成三条dsRNA序列,家蚕幼虫感染病毒后体腔注射dsRNA,RT-PCR检测靶基因表达。每头5龄蚕注射4~6 ng/mg剂量的dsRNA,能够干扰BmCPV-RDRP基因的表达;注射dsRNA后感染病毒的处理区干扰效率可达93%,而注射dsRNA前感染病毒的干扰效率可达99.9%;同时,检测BmCPV的二个结构蛋白基因片段(S1、S5),其表达水平随着RDRP基因表达水平降低而降低,推测dsRNA干扰BmCPV-RDRP基因表达能够影响病毒的增殖。4.构建了表达dsRNA的转基因载体。克隆家蚕中肠特异性启动子P2,构建了中间表达载体PBM-P2-dsRNA-eGFP,家蚕细胞瞬时转染和RT-qPCR检测,结果表明启动子P2能够表达dsRNA而形成shRNA(small hairpin RNA);以P2-dsRNA序列为目的基因,基于piggyBac转座子构建获得表达dsRNA的转基因载体pig-P2-dsRNA-ploy(A)-eGFP-neo,家蚕细胞转染和RT-qPCR检测表明构建的转基因载体能够表达dsRNA。
【学位单位】：江苏科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S884.52
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 BmCPV研究进展
    1.2 家蚕抗BmCPV研究进展
    1.3 miRNAs概述
    1.4 病毒编码的miRNA研究进展
    1.5 RNAi抗病毒研究进展
    1.6 本文主要内容
第二章 一般材料与方法
    2.1 一般材料
        2.1.1 生物材料
        2.1.2 工具酶和所用相关试剂盒
        2.1.3 培养基
        2.1.4 核酸引物和测序
        2.1.5 试剂配置
        2.1.6 常用仪器
    2.2 常用方法
        2.2.1 制备感受态细胞
        2.2.2 DNA连接的反应体系
        2.2.3 连接产物的转化
        2.2.4 重组质粒的筛选
        2.2.5 采用碱裂解法来制备少量质粒DNA
        2.2.6 DNA目的片段分离和回收
        2.2.7 PCR扩增技术
        2.2.8 琼脂糖凝胶电泳
        2.2.9 提取总RNA
        2.2.10 RNA反转录cDNA
        2.2.11 定量PCR（Quantitative PCR）
第三章 BmCPV编码miRNA的分析和鉴定
    3.1 引言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 试验材料
        3.2.2 试验方法
    3.3 试验结果与分析
        3.3.1 从感染BmCPV家蚕中肠小RNA文库中预测miRNAs
        3.3.2 BmCPV的miRNA生物信息学分析
        3.3.4 miR靶基因的预测
    3.5 讨论
    3.6 本章小结
第四章 BmCPV-miRNA对病毒本身基因表达调控研究
    4.1 引言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 试验材料
        4.2.2 试验方法
    4.3 试验结果与分析
        4.3.1 miR-3 和Inhibition-miR-3 对BmCPV基因表达的影响
        4.3.2 miR-5 和Inhibit-miR-5 对BmCPV基因表达的影响
    4.4 讨论
    4.5 本章小结
第五章 dsRNA干扰BmCPV-RDRP基因表达研究
    5.1 引言
    5.2 材料和方法
        5.2.1 试验材料
        5.2.2 试验方法
    5.3 试验结果与分析
        5.3.1 BmCPV-RDRP基因表达特征
        5.3.2 BmCPV基因检测引物的验证
        5.3.3 注射液在家蚕体腔内扩散的模拟实验
        5.3.4 dsRNA对BmCPV-RDRP的干扰效果
        5.3.5 BmCPV-RDRP基因抑制后对病毒基因组其它片段表达的影响
    5.4 讨论
    5.5 本章小结
第六章 基于piggyBac转座子的表达dsRNA转基因载体构建及检测
    6.1 引言
    6.2 材料和方法
        6.2.1 试验材料
        6.2.2 试验方法
    6.3 试验结果与分析
        6.3.1 Bm-P2启动子的克隆和在线分析
        6.3.2 中间载体Bm-P2-dsRNA构建及表达效果检测
        6.3.3 转基因表达载体构建及细胞转染检测
    6.4 讨论
    6.5 本章小结
结论
参考文献
攻读学位期间发表的学术论文和成果
致谢
附录一 Abbreviations list


本文编号：2861523