梨PbFWLs和PsPL基因的克

发布时间：2020-10-31 03:28

　　 梨(Pyrus spp)是继葡萄和苹果后,世界上第三大温带水果。在梨的生产栽培过程中,果实大小是果品分级和果园经济效益的主要决定因素,果实硬度与果实口感、货架期长短息息相关。分析影响果实大小、硬度的内在原因、掌握基因对果实大小、硬度的调控机制对选择优良基因型品种、建立育种计划、提高果实商品性有很大帮助。本研究以小果型野生杜梨、中果型栽培种香梨和大果型栽培种鸭梨为试验对象,通过组织解剖学研究了果实细胞大小、数目与梨果实大小的关系;利用同源克隆的方法分离了两个梨fw2.2同源基因,对其进行了生物信息学、亚细胞定位以及表达分析,并在超表达转基因植株中进行了功能验证;分离了PL同源基因,并对其进行了生物信息学、表达分析及原核表达。为进一步研究控制梨果实大小与硬度的分子机理提供理论依据。主要研究结果如下:1.香梨和鸭梨果实单果重、体积生长曲线均为单S型,呈“慢-快-慢”趋势,杜梨果实在整个生长发育过程中生长缓慢,果实生长动态几乎为一条直线,S型曲线特征不明显。香梨和鸭梨的纵横径生长动态曲线类似S型,而杜梨纵横径生长动态为缓慢增长的直线。前期香梨和鸭梨果实纵径生长比横径生长快;后期香梨和鸭梨果实横径生长要比纵径生长快,杜梨果实纵横径生长速率基本一致且增长缓慢。2.通过对梨果实不同时期纵横径切片观察发现:三个梨品种果肉组织细胞生长动态大致相似,果肉组织细胞体积在不同时期大小一致,其中香梨和鸭梨果肉组织细胞增大的动态与果实重量和果实体积的生长动态基本同步。计算果实细胞数目发现:梨品种间大小差异是由细胞数目决定的,而不是细胞体积。3.利用同源克隆方法,通过RT-PCR和RACE技术,成功分离了梨两个fw2.2同源基因,命名为PbFWL1与PbFWL2。PbFWL1编码了214个氨基酸,分子量约为24.067 kDa,理论等电点pI为6.25,分子式为C1042H1568N296O316S24;PbFWL2编码了208个氨基酸,分子量约为23.076 kDa,理论等电点pI为5.67,分子式为C1004H1514N272O311S22,两个蛋白均为亲水性蛋白。PbFWL1与PbFWL2蛋白之间的同源性为82.71%,与番茄FW2.2蛋白的同源性分别为44.39%和44.23%。两个蛋白都含有PLAC8保守结构域和CCXXXXCPC模序。三个梨品种的PbFWLs cDNA序列完全一致。4.在三个梨品种果实生长发育过程中,PbFWLs mRNA水平在各个时期总体表现为小果高于大果的趋势。鸭梨PbFWL1除了在135 DAFB表达量较高,在其余时期的表达量和PbFWL2的表达量均保持在一个很低的水平;杜梨的PbFWL1与PbFWL2表达量均为最高,但是在一些时期和香梨的表达量差异不大。PbFWLs基因表达量的上升与下降没有特别的规律,但是在果实细胞分裂时期,PbFWL1与PbFWL2表达量均为杜梨香梨鸭梨,与梨果实大小呈负相关关系。5.将PbFWLs基因全长cDNA序列插入到pCAMBIA1304双元表达载体的BglⅡ与SpeⅠ限制性内切酶位点之间,构建成瞬时表达载体pCAMBIA1304-PbFWLs。用农杆菌介导法将构建好的质粒导入洋葱表皮细胞中。荧光共聚焦显微镜观察显示:在波长为480 nm光源激发下,含有定位信号肽的pCAMBIA1304-PbFWL1和pCAMBIA1304-PbFWL2都在细胞膜上检测到了荧光信号,而在细胞核、细胞质上未检测到荧光信号,说明pCAMBIA1304-PbFWLs主要存在于在细胞膜上,可能为膜蛋白。6.构建了PbFWLs基因植物超表达载体pCAMBIA1303-PbFWLs,浸花法转化拟南芥,成功获得PbFWLs转基因植株,结果发现:PbFWL1过量表达的T2代转基因植株地上部分的组织、器官略比对照植株小,地下部分无明显差异;PbFWL2过量表达的T2代转基因植株大小与对照植株无差异。7.利用同源克隆方法,通过RT-PCR和RACE技术,分离了香梨PL同源基因,命名为PsPL。PsPL编码了414个氨基酸,分子量约为45.17 kDa,理论等电点pI为6.78,分子式为C1977H3084N574O604S21,为不稳定蛋白。该蛋白质属于果胶裂解酶家族基因,含有一个右手β螺旋结构与苹果PL蛋白的同源性最高,达97%8.将PsPL基因全长cDNA序列插入到pET28a(+)原核表达载体的BamHⅠ与HindⅢ限制性内切酶位点之间,构建成原核表达载体pET-PsPL。在BL21大肠杆菌内,经1.0 mmol/L IPTG诱导,37℃220 rpm 2 h就可以大量表达,且随着时间的延长,表达的蛋白量差异不大。9.从香梨果实生长发育后期到货架期,果实硬度不断下降;PsPL的表达水平呈先升高后下降的趋势,没有和香梨果实软化同步,推测PsPL可能在香梨完全成熟后才大量表达。
【学位单位】：新疆农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S661.2
【部分图文】：

梨 PbFWLs 和 PsPL 基因的克隆、表达与功能初步分析抑制作用[92]。樱桃中也分离出了 fw2.2 家族成员基因，其中甜樱桃中 PavCNR12、PavCNR20 基因可能与果实大小相关，PavCNR12 还可能与酸樱桃大小有关[93]。目前，已有 14 种植物的基因组序列被挖掘出类似番茄 fw2.2 的基因，并以验证了103 个 FWL 基因[92]。大多数植物 FWL 蛋白质由 100 至 250 个氨基酸构成，有些大于 400个氨基酸。FW2.2 蛋白同源物之间氨基酸序列比对发现了一个高度保守的核心结构域。该核心区域被分成三个子结构域：1 或 2 个跨膜结构域被两个半胱氨酸/富含脯氨酸的结构域所包围。半胱氨酸和脯氨酸残基的保守区域，和已知影响蛋白质结构的氨基酸，支撑了 FWL 核心领域三级结构的保守性和其可能行使的关键功能[94]（图 1-1）。

图 2-1 不同时期三个品种梨果实生长发育动态Fig 2-1 Fruit development. The fruit at different days after full bloom (DAFB) are shown

16左边 Y 轴显示为香梨与鸭梨；右边 Y 轴显示为杜梨The left Y-axis represent for Korla fragrant pear and Yali pear; The right Y-axis represent for Duli pear图 2-2 梨果实重量（A）、体积（B）生长发育曲线Fig 2-2 Fruit growth curves, The increasements of fruit weight (A) and fruit volume (B).2.2.2 梨果实纵、横径的生长发育动态香梨和鸭梨的纵横径生长动态曲线类似 S 型，杜梨没有明显的快速增长时期，纵横
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本文编号：2863386