水貂阿留申病毒分离鉴定及其致病性研究和诊断方法的建立

发布时间：2020-11-09 22:51

　　 水貂阿留申病(Aleutian Disease,AD)是由水貂阿留申病毒(Aleutian Mink Disease virus,AMDV)引起的水貂慢性进行性疾病。水貂感染AMDV后主要症状为:采食下降、被毛粗乱、母貂空怀、流产或死胎,公貂出现生殖能力下降,少数出现急性死亡。该病与水貂病毒性肠炎、水貂犬瘟热并称为影响水貂健康的三大疫病,AD给养貂业造成了严重的经济损失,目前,在世界范围内的水貂养殖地区均可见AD的发生。多年来世界各地养殖水貂国家的科研机构一直努力开展疫苗研发工作,但因各种原因,始终未见成效。由于一直没有有效的预防手段,使得AD得以迅速蔓延,当前控制该病的最有效方法为:定期检疫、淘汰阳性水貂、逐步净化种群、建立无疫病养殖场。研究表明,我国貂群的AD血清学阳性率高达80%,因而有针对性的分离、鉴定我国流行毒株,研究病毒基因组进化规律以及病毒的致病特性,建立健全适合的检测方法,将有利于我国开展AD的诊断、防治、净化。本研究主要包括以下4个部分:(1)AMDV的分离鉴定及基因组进化分析采集黑龙江某水貂场经对流免疫电泳(counter immune electrophoresis,CIEP)检测为AD阳性,且临诊症状明显的水貂肝脏、脾脏。组织通过研磨处理后接种猫肾细胞(CRFK)以进行AMDV的分离。利用病毒形态学及分子生物学手段确认自发病动物体内成功分离到一株AMDV,命名为AMDV-HLJ。提取病毒基因组,PCR方法扩增相应片段,经过拼接,获得了部分NS1基因序列以及全部的VP2基因序列。遗传进化分析表明,AMDV-HLJ可能与国内分离株LN1/LN2株由相同的祖先病毒进化而来。通过对VP2蛋白中和性抗原结构域的研究发现,AMDV-HLJ株在两个中和性抗原优势区的5个位点存在氨基酸突变,但这些突变并未影响病毒的抗原性及致病性。(2)病毒分离株致病性分析将分离的病毒AMDV-HLJ感染健康水貂,通过临诊症状、剖检的眼观病变、脏器的病理学损伤以及病毒基因组的原位杂交等试验手段研究AMDV-HLJ株对水貂的致病机制。结果表明,AMDV-HLJ可导致水貂的严重发病,甚至死亡。病毒感染水貂后,其呈现多器官损伤;在组织病理学层面,病毒感染水貂的神经系统、呼吸系统、免疫系统、消化系统、泌尿系统和生殖系统相应器官均可出现典型的病毒感染病变,该结果进一步表明,AMDV的感染可能会诱发细菌的继发感染;组织原位杂交实验表明,AMDV不仅仅存在于单核-巨噬细胞系统中,在睾丸生精细胞、II型肺泡上皮细胞、小脑浦肯野细胞内均可检测到病毒核酸,上述结果均表明,AMDV可在感染机体的多种器官内的不同细胞复制,其可能利用多种致病机制损伤被其感染的宿主。(3)水貂阿留申病CIEP检测方法的建立CIEP作为一种简便易行的AD血清学检测方法,一直以来以其准确、高效、成本低等优势作为AD抗体检测通用手段。但我国AD的CIEP检测一直以来严重依赖进口抗原,国产抗原也是源于进口毒株,其与本地流行毒株抗原性差距较大。本实验利用AMDV-HLJ分离株进行CIEP抗原制备,优化制备流程,在不影响特异性和敏感性的前提下提高产出量。研究表明,基于分离毒株制备的CIEP抗原具有良好的特异性和敏感性,可应用于日常的实验室或者现地AMDV抗体检测。(4)可视化环介导等温扩增(LAMP)检测AMDV方法的建立在日常生产中,分子水平的AMDV检测与血清学检测手段互为补充。本研究成功建立了简单、高效、敏感、经济的AMDV LAMP检测方法。研究表明,利用设计的6条引物能够有效扩增AMDV基因组,LAMP反应在65°C 45min条件下达到扩增产物的最大量值;敏感性试验表明,LAMP方法比传统的PCR方法敏感100倍,且检测结果可直接用肉眼观察、判定,而不需要其他特殊的仪器装置。利用该方法对现地样品的检测表明其适用于日常AMDV的分子检测。目前国内对于AD及AMDV的研究相对较少,本研究以国内流行毒株为研究切入点,分别从病毒进化、致病机制及诊断方法三个层面探讨中国AMDV分离株的生物学特性,为我国的AD防控起到积极作用。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S858.92
【部分图文】：

促使人们发现 AD 是一种传染性疾病。1962 年由几位学的传染病特性[2,54]。1977 年，Porter 等证实，AD 病毒是细小月，病毒分类委员会最新病毒分类报告中，AMDV 被细小病毒亚科（Parvovirinae）、貂阿留申病毒属（Amdo与牛犬细小病毒属（Bocavirus）是细小病毒亚科的新成virus）、依赖病毒属（Dependovirus）、红细胞病毒属（E5 个病毒属。的形态结构和理化特征小病毒一样，AMDV 的组成包括一条单股线性 DNA 和对称，无囊膜、糖类和脂类，直径 23～35nm[57]，分子质 1.42～1.44g/cm3，沉降系数为 110S。由于病毒结构简单。对 DNA 酶不敏感，对蛋白酶敏感。一般有机溶剂，无影响。病毒耐高温，80°C 存活 1h，90°C 存活 10min，林 4 周灭活。可紫外灭活，对强酸、强碱及 0.5%碘敏感[

图 2-1 CIEP 平板示意图Fig. 2-1 The abridged general view of CIEP agarose plate分离培养胞复苏后接于 25cm2细胞瓶，全培养液为 10%胎牛血清的 MEM， 24h 内细胞长成单层约 60%左右，可接毒。

细胞球缩、融合、脱落，残留的贴壁细胞呈纤长状。ck infected cells were used as negative control, did not change. B: The CPE on CRFK afteinoculation 6 days, amount of necrotic cells, shrinkage, fusion, shedding.图 3-1 接毒后 CRFK 细胞病变Fig. 3-1 The CPE on CRFK after virus inoculation
【参考文献】

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1 刘风波;闫芳;许蓓;冯晓东;吴倩;;鸡传染性法氏囊病继发大肠杆菌病的诊治[J];国外畜牧学(猪与禽);2010年02期

2 吴威;聂金珍;程世鹏;牛景华;苗丽;吴玉林;;水貂阿留申病对流免疫电泳细胞抗原制备新方法的研究[J];中国农学通报;1990年06期

3 关中湘,王树志,向敬芝,朴厚坤,孙振天,吴凤阁,林则君,赛友联,金玉英,孔照花,李建国,迟金山,马春仿,刘灵云,马俊,金学锋,刘桂仁,崔义成;水貂阿留申病对流免疫电泳用诊断抗原的制备和试用[J];畜牧兽医学报;1987年01期

本文编号：2877068