C型产气荚膜梭菌性腹泻仔猪回肠miRNA的鉴定及miR-500的生物学功能研究

发布时间：2020-11-11 23:30

　　 仔猪腹泻是一种以新生和幼龄仔猪为主的肠道传染性疾病,在养猪生产中普遍存在,严重影响了养猪业的经济效益。C型产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens type C,C.perfringens type C)是引起仔猪腹泻的主要病原菌之一。尽管通过提高饲养管理水平、接种疫苗和药物防治等措施在一定程度上减少了仔猪腹泻的发生,但由于仔猪的耐药性使得对腹泻防治的难度不断加大。因此,从长远来看,采用遗传学方法从遗传本质上提高仔猪对腹泻的抗性,是减少仔猪腹泻发生的重要手段。研究发现,miRNA在调控大肠杆菌和沙门氏菌感染引起仔猪腹泻的过程中发挥着重要作用,而且诸多研究已证实小肠在仔猪抵抗病原菌感染过程中有重要调控功能,但回肠中miRNA如何参与调控C型产气荚膜梭菌引起仔猪腹泻的功能尚不清楚。鉴于此,本研究选取30头7日龄健康仔猪(长×大),随机选取5头仔猪作为对照组(IC),其余25头仔猪进行C型产气荚膜梭菌口服攻毒试验,根据腹泻总评分筛选出易感组(IS)和耐受组(IR)仔猪,采用高通量测序技术对IC、IS和IR仔猪的回肠组织进行Small RNA测序,获取差异表达miRNA,预测差异表达miRNA靶基因,并进行GO功能和KEGG信号通路富集分析,筛选与仔猪C型产气荚膜梭菌性腹泻抗性相关的miRNA,在IPEC-J2细胞上研究其生物学功能。主要的研究结果:(1)共获得617个miRNA(319个已知miRNA和298个新miRNA),对其表达量进行了显著性统计分析,共有53个差异表达miRNA。IS vs IC、IR vs IS和IR vs IC三个比较组分别有40个(20上调和20个下调)、10个(4上调和6个下调)和19个(9个上调和10个下调)差异表达miRNA。(2)GO功能富集分析发现,差异表达miRNA的靶基因主要富集在炎症反应的调控(Regulation of inflammatory response)、免疫系统过程(Immune system process)、白细胞介素-6产生的调控(Regulation of interleukin-6 production)、MAPK活性的激活参与先天免疫反应(Activation of MAPK activity involved in innate immune response)等一些与免疫、炎症反应相关的GO功能。(3)KEGG信号通路分析发现,这些靶基因主要富集在一些与感染性疾病、免疫相关的信号通路,如MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、ErbB信号通路(ErbB signaling pathway)、Jak-STAT信号通路(Jak-STAT signaling pathway)、Wnt信号通路(Wnt signaling pathway)、ECM受体的交互作用(ECM-receptor interaction)等。(4)筛选出了1个与C型产气荚膜梭菌性腹泻抗性相关的关键miRNA,即miR-500,RT-qPCR结果显示其靶基因HSPA2表达量IS和IR组显著高于IC组(P0.05),且IS组显著高于IR组(P0.05);靶基因TDP2表达量IR组显著高于IC组(P0.05),IS组极显著高于IC组(P0.01),且IS组显著高于IR组(P0.05)。(5)成功构建了靶基因HSPA2和TDP2的野生型和突变型双荧光素酶载体(psi-CHECK~(TM)-2-HSPA2-3'UTR WT、psi-CHECK~(TM)-2-HSPA2-3'UTR Mut、psi-CHECK~(TM)-2-TDP2-3'UTR WT、psi-CHECK~(TM)-2-TDP2-3'UTR Mut)。双荧光素酶报告基因实验结果显示:靶基因HSPA2和TDP2的野生型载体+mimics组荧光素酶活性极显著低于野生型载体+mimics NC组(P0.01),突变型载体+mimics组与突变型载体+mimics NC荧光素酶活性差异不显著(P0.05);mimics+psi-CHECK~(TM)-2组与mimics NC+psi-CHECK~(TM)-2组荧光素酶活性差异不显著(P0.05)。(6)RT-qPCR结果显发现,miR-500 mimics转染组HSPA2和TDP2基因的表达量极显著低于mimics NC转染组(P0.01),miR-500 inhibitor转染组HSPA2和TDP2基因的表达量极显著高于inhibitor NC转染组(P0.01)。WB结果发现,靶基因TDP2的蛋白表达量在miR-500 mimics转染组极显著低于mimics NC(P0.01),miR-500 inhibitor转染组极显著高于inhibitor NC(P0.01);HSPA2蛋白表达量在miR-500 mimics转染组极显著低于mimics NC(P0.01),而miR-500 inhibitor转染组显著低于inhibitor NC(0.05P0.01)。(7)MTT、CCK8和EDU法检测结果发现,miR-500 mimics转染组细胞活力均极显著高于mimics NC转染组(P0.01),miR-500 inhibitor转染组细胞活力均极显著低于inhibitor NC转染组(P0.01)。(8)Beta2毒素侵染IPEC-J2细胞后,miR-500的表达量极显著降低(P0.01),LDH活性极显著增强(P0.01),miR-500 mimics转染组LDH活性极显著低于mimics NC转染组(P0.01),miR-500 inhibitor转染组LDH活性极显著高于inhibitor NC转染组(P0.01);炎性细胞因子IL-6、IL-7、IL-8和TNF-α的表达量均为miR-500 mimics转染组极显著低于mimics NC组(P0.01),miR-500inhibitor转染组极显著高于inhibitor NC组(P0.01);而IL-10的表达量miR-500mimics转染组极显著高于mimics NC组(P0.01),miR-500 inhibitor转染组极显著低于inhibitor NC组(P0.01)。综上所述,我们挖掘出了1个与C型产气荚膜梭菌性腹泻抗性相关的关键miRNA,即miR-500;miR-500可靶向调控HSPA2和TDP2基因的mRNA和蛋白的表达,促进IPEC-J2细胞的增殖,并且可减弱Beta2毒素对IPEC-J2细胞的毒性,抑制促炎细胞因子和诱导抗炎细胞因子的释放。miR-500在仔猪感染C型产气荚膜梭菌引起的腹泻过程中起着重要的调控作用,研究结果可为腹泻抗性猪品系的培育提供参考。
【学位单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S858.28
【部分图文】：

首先将目的片段连接到pMDTM19-T载体(图3-1)上,然后将连接成功的pMDTM19-T载体和psi-CHECKTM-2空载体(图3-2)分别用Xho I和Not I快切酶进行双酶切,用T4 DNA连接酶连接在一起,然后转化、涂板、挑菌、菌液PCR、测序(苏州金唯智生物科技有限公司)、提取质(无内毒素质粒小提中量试剂盒),获得HSPA2和TDP2基因野生型载体psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR WT和psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR WT,保存于-20℃备用。具体试验步骤如下:图3-2 psi-CHECKTM-2载体图谱

图3-1 pMDTM19-T载体图谱(1)PCR扩增:以猪小肠上皮细胞系(IPEC-J2)的c DNA为模板,PCR扩增靶基因HSPA2和TDP2的3’UTR区含有miR-500结合位点的部分DNA寡聚核苷酸序列(该序列含有Xho I和Not I酶切位点),引物序列见表3-2,由苏州金唯智生物科技有限公司合成。反应体系为20μL:2×Taq PCR Master Mix 10μL,上下游引物各1.0μL,cDNA模板2ul,ddH2O补至20μL。PCR扩增反应程序为:95℃预变性5min,94℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸60s,共31个循环;72℃延伸10min,4℃保存。取5μL PCR产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

本研究成功构建了靶基因HSPA2和TDP2及突变结合位点后的双荧光素酶载体,并成功获得了各自对应的野生型和突变型载体质粒。图3-3为miR-500与其靶基因HSPA2和TDP2(及突变后的HSPA2和TDP2 Mut)结合位点的结合示意图。扩增HSPA2和TDP2 3’UTR区部分核苷酸序列(图3-4 A),并成功构建其双荧光素酶载体,酶切鉴定如图3-4 B。经过测序验证获得HSPA2和TDP2部分3’UTR区双荧光素酶载体psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR WT、psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR WT及其突变载体psi-CHECKTM-2-HSPA2-3"UTR Mut、psi-CHECKTM-2-TDP2-3"UTR Mut质粒,测序峰图见图3-5。图3-4 HSPA2和TDP2基因3’UTR区部分序列的PCR扩增图(A)和双荧光素酶载体酶切图(B)
【参考文献】

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本文编号：2879907