莲藕膨大的蛋白质组和磷酸化蛋白质组研究及莲CONSTANS-like基因家族分析
发布时间：2020-11-13 18:04
莲是莲科莲属的多年生水生植物。莲属植物仅包括亚洲莲和美洲黄莲两个种。其中,亚洲莲通常称为莲、荷花,在亚洲特别是中国栽培广泛,以下统称为莲。莲花多用于水生植物造景,荷叶因其富含荷叶碱可用于茶叶制造,莲的地下茎在亚洲是常见的蔬菜,因其含有丰富的维生素和矿物质等营养元素且热量适中而常见于食品加工和人们的日常餐点中。莲根据生态型可分为热带莲和温带莲,二者具有不同的地下茎形态。热带莲地下茎不膨大,温带莲以其地下茎膨大成藕著称。随着气温降低和莲地上部分凋落,莲藕作为莲越冬的物质储藏器官,逐渐积累淀粉等物质,莲藕膨大约在3个月内完成。莲藕的膨大决定了莲的生长发育的物质基础和下一生长周期的能量来源,是一项复杂的生理过程。此外,莲藕膨大对于提高其产量,进而提高其在农业生产中的经济效益具有重要意义。然而,目前对莲藕膨大的分子机理知之甚少,对其研究尚处在初期阶段。为深入揭示其分子调控机理,本研针对这一过程中的蛋白质表达水平以及磷酸化修饰的动态变化特点展开研究工作;同时,对莲CONSTANS-like基因家族开展系统研究,并对其成员NnCOL5进行功能解析。主要研究内容及结果如下:(1)对莲藕发育的关键时期:鞭状茎时期(S1),膨大中期(S2),莲藕时期(S3),进行了定量比较蛋白质组学分析。通过质谱分析共鉴定到2712种可定量的蛋白质。其中,发育阶段特异性表达的蛋白质(SSP)302个,不同阶段差异表达的蛋白质(DEP)172个。发育阶段特异表达蛋白质的功能富集分析发现不同时期的蛋白质承担的主要功能有不同的侧重:在S1阶段主要富集到氧化和金属离子响应通路;S2阶段主要是细胞生长和分裂相关的蛋白被富集;S3阶段富集到的蛋白质多与淀粉的生物合成相关。此外,蛋白质组学研究鉴定到大量与光信号、生长素信号和钙离子信号传导相关的蛋白质的差异表达。推测莲藕膨大过程中光信号和生长素信号以及钙离子信号通路都参与其中。(2)对鞭状茎时期(S1),膨大中期(S2),莲藕时期(S3)的莲地下茎同时也开展了磷酸化蛋白质组学研究。共鉴定出2286个发生磷酸化修饰的蛋白质。其中,能进行定量分析的蛋白质835个。其中57%的蛋白质仅在磷酸化蛋白质组分析中得到鉴定,说明其表达量极低。比较分析共鉴定到发育阶段特异发生磷酸化修饰的蛋白质(SSPp)373个;不同阶段磷酸化修饰强度发生变化的蛋白质(DEPp)有230个;在莲藕膨大过程中既存在蛋白质表达水平发生变化,也存在磷酸化修饰强度发生变化的蛋白质共有133个,通过GO和KEGG富集分析,发现许多生长素等激素信号传导以及淀粉、糖代谢相关蛋白质的磷酸化修饰状态对于莲藕膨大可能具有重要作用;(3)通过对莲CONSTANS-like家族基因、蛋白结构和在莲藕发育过程中转录组数据分析,我们发现NnCOL5基因的表达随莲藕发育进程而升高,与莲藕膨大具有正相关性。NnCOL5蛋白结构由一个BBX和一个CCT功能域组成,定位于细胞核内。马铃薯中过表达NnCOL5引起了短日照条件下微型薯块茎单株薯重和淀粉的显著升高。通过转录组分析发现过表达NnCOL5影响了马铃薯内源激素信号传导尤其是生长素信号传导途径,其次富集到包括淀粉和糖代谢等基因,并影响了CO-FT通路关键因子的表达。推及莲藕膨大的生理进程,NnCOL5可能通过影响生长素信号转导和淀粉合成等途径,促进莲藕膨大。综合本研究,结合蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学以及NnCOL5功能分析数据,我们提出了温带莲莲藕膨大的工作模型。在长日照条件下,莲通过PHYA和FYPP等感知光信号,促进地下茎伸长生长,同时可逆磷酸化修饰作用下的抑花因子FRIGIDA起到抑制开花的作用。生长素信号在莲地下茎发育前期起到促进细胞分裂的作用。随着短日照的来临,NnCOL5负作用于生长素信号途径,并且干涉CO-FT途径关键基因的表达,促进莲藕膨大。钙离子信号也参与其中,钙调素蛋白和CPK等蛋白发生可逆磷酸化修饰调控蛋白丰度,促进了莲藕膨大过程中的物质运输。研究结果对于深入认识莲藕膨大的调控机理,促进莲藕育种及产业发展具有重要意义。
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S645.1
【部分图文】：
根据莲的生物学特性和生态习性观察、实地考察以及区域性试验,莲存在两大自然生态型,即温带型和热带型,它们具有明显不同的生长发育习性。这两种生态型最主要区别之一就是地下茎形态的不同,莲藕根状茎形态有两种形式,一种为莲鞭,其由多个节和节间组成,细长如鞭(陈维培1988),另一种是藕,即由莲鞭顶端膨大形成的根状茎(图1.1)。温带型莲(如中国古代莲)有明显的年生长发育周期,在华中地区6-8月份开花结实,秋季地上部枯萎凋谢,地下茎则膨大成藕而休眠(图1.2)。温带型莲即使移种至热带地区(如泰国),其地下茎仍能膨大成藕。热带型莲(如泰国莲)在热带气候条件下,长年不停顿生长,地下茎不膨大成藕,而呈鞭状生长,但在温带地区会根据生长环境进行一定程度的贮藏器官膨大,绿叶期约从5月到11月长达7个月,花期约从6月到11月总长约5个月(张行言2006)。一般情况,莲育种利用藕苫和莲子进行繁殖。莲藕的苫芽萌动在4月份;种子经过处理后,从播种到长根长叶大约需要5~7天;5月中下旬立叶浮出水面;6月中下旬始花期;7、8月份进入盛花期;9月上旬为末花期;果熟期从7月下旬到9月中旬,同时也是地下茎膨大和充实期;9月下旬开始进入叶黄期,10月中旬后进入休眠期;整个生育期大概190天。莲的生活周期因地域而稍有差异,南方气候温和,萌发和开花要早于北方。
温带型莲(如中国古代莲)有明显的年生长发育周期,在华中地区6-8月份开花结实,秋季地上部枯萎凋谢,地下茎则膨大成藕而休眠(图1.2)。温带型莲即使移种至热带地区(如泰国),其地下茎仍能膨大成藕。热带型莲(如泰国莲)在热带气候条件下,长年不停顿生长,地下茎不膨大成藕,而呈鞭状生长,但在温带地区会根据生长环境进行一定程度的贮藏器官膨大,绿叶期约从5月到11月长达7个月,花期约从6月到11月总长约5个月(张行言2006)。一般情况,莲育种利用藕苫和莲子进行繁殖。莲藕的苫芽萌动在4月份;种子经过处理后,从播种到长根长叶大约需要5~7天;5月中下旬立叶浮出水面;6月中下旬始花期;7、8月份进入盛花期;9月上旬为末花期;果熟期从7月下旬到9月中旬,同时也是地下茎膨大和充实期;9月下旬开始进入叶黄期,10月中旬后进入休眠期;整个生育期大概190天。莲的生活周期因地域而稍有差异,南方气候温和,萌发和开花要早于北方。1.1.3 莲的组学研究和分子生物学研究
在马铃薯块茎发育的通路研究中,以CO-FT通路研究的最为透彻(图1.3)。马铃薯中的研究表明,COL1在StSP5G(S.tuberosum SELF-PRUNING 5G,FT同源基因)的启动子中结合了TGTGGT元素,从而抑制了马铃薯块茎的形成(Abelenda,Cruz-Oro et al.2016)。StCDF1是一种转录调节因子,通过下调StCO表达并激活StSP6A(S.tuberosum SELF-PRUNING 6A,FT同源物)的表达的块茎信号来控制植物的成熟并介导块茎的发生(Kloosterman,Abelenda et al.2013)。该途径的其他成员包括FLAVIN-BINDING,KELCH REPEAT,F-BOX 1(FKF1),GIGANTEA(GI)和CYCLING DOF FACTOR 1(CDF1)蛋白质都参与调节CO的转录。在短日照条件下,拟南芥AtCO表达在夜间达到峰值,而在白天保持低表达;在长日照条件下,蓝光感光体FKF1的积累可增强AtCO的表达(Imaizumi,Tran et al.2003)。在长日照条件,AtCDF1对CO的抑制作用通过与其启动子结合实现,而FKF1蛋白则通过其LOV结构域与CO相互作用,起到稳定CO蛋白的作用(Sawa,Nusinow et al.2007,Song,Smith et al.2012)。在马铃薯(Solanum tuberosum)中,CO基因表达的昼夜振荡与拟南芥中不同。AtCO和Hd1(水稻中的FT同源物)转录水平在黄昏达到峰值,而马铃薯StCOL1在黎明表达峰值(de Montaigu,Rühl et al.2015)。在马铃薯安第斯亚种中过表达AtCO可以延缓短日照条件下马铃薯块茎的形成。在CO-FT通路中,CONSTANS/CONSTANS-like(CO/COL)家族成员担任了非常重要的角色。拟南芥中的CO/COL家族根据其蛋白质结构分为三个亚族,Ⅰ的结构特点是包含2个b-box结构和一个CCT结构由6个保守氨基酸组成(Griffiths,Dunford et al.2003),成员有CO及COL1-COL5;Ⅱ群结构为只含有一个b-box结构,成员有COL6-COL8和COL16;Ⅲ群包含一个b-box,一个次级分叉的锌指蛋白结构,成员有COL9-COL15,三个亚族的所有蛋白质都在C端存在一个CCT结构域(Robson,Costa et al.2001)。CO/COL在拟南芥和水稻中都具有调控开花的作用(Valverde 2011),它的同源基因序列和功能具有高度保守性,各种各样的植物中都存在着CO/COL的同源基因(Khanna and Wu 2009)。COL蛋白在许多植物中都承担着转录激活的功能(Putterill,Robson et al.1995,Tiwari,Shen et al.2010,Chen 2012),有趣的是决定COL蛋白的转录活性的区域既不在b-box上也不在CCT功能域,而是在两个结构之间的谷氨酸富集区。CO主要在叶片中表达并接受光信号,在挪威云杉(Picea abies)中研究表明,针叶中表达量高于根尖(Holefors,Opseth et al.2009)。在蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)中也有证实COL蛋白在叶片中负责感受光信号(Valverde 2011,Zhang,Wu et al.2011)。在拟南芥CO在长日照下促进拟南芥开花(Robson,Costa et al.2001)。在马铃薯中过表达拟南芥的CO基因,能够抑制马铃薯块茎的膨大,而沉默马铃薯StCO基因,能够促使马铃薯块茎膨大(Navarro,Cruz-Oróet al.2015)。
【参考文献】
本文编号：2882466
【学位单位】：中国科学院大学(中国科学院武汉植物园)
【学位级别】：博士
【学位年份】：2020
【中图分类】：S645.1
【部分图文】：
根据莲的生物学特性和生态习性观察、实地考察以及区域性试验,莲存在两大自然生态型,即温带型和热带型,它们具有明显不同的生长发育习性。这两种生态型最主要区别之一就是地下茎形态的不同,莲藕根状茎形态有两种形式,一种为莲鞭,其由多个节和节间组成,细长如鞭(陈维培1988),另一种是藕,即由莲鞭顶端膨大形成的根状茎(图1.1)。温带型莲(如中国古代莲)有明显的年生长发育周期,在华中地区6-8月份开花结实,秋季地上部枯萎凋谢,地下茎则膨大成藕而休眠(图1.2)。温带型莲即使移种至热带地区(如泰国),其地下茎仍能膨大成藕。热带型莲(如泰国莲)在热带气候条件下,长年不停顿生长,地下茎不膨大成藕,而呈鞭状生长,但在温带地区会根据生长环境进行一定程度的贮藏器官膨大,绿叶期约从5月到11月长达7个月,花期约从6月到11月总长约5个月(张行言2006)。一般情况,莲育种利用藕苫和莲子进行繁殖。莲藕的苫芽萌动在4月份;种子经过处理后,从播种到长根长叶大约需要5~7天;5月中下旬立叶浮出水面;6月中下旬始花期;7、8月份进入盛花期;9月上旬为末花期;果熟期从7月下旬到9月中旬,同时也是地下茎膨大和充实期;9月下旬开始进入叶黄期,10月中旬后进入休眠期;整个生育期大概190天。莲的生活周期因地域而稍有差异,南方气候温和,萌发和开花要早于北方。
温带型莲(如中国古代莲)有明显的年生长发育周期,在华中地区6-8月份开花结实,秋季地上部枯萎凋谢,地下茎则膨大成藕而休眠(图1.2)。温带型莲即使移种至热带地区(如泰国),其地下茎仍能膨大成藕。热带型莲(如泰国莲)在热带气候条件下,长年不停顿生长,地下茎不膨大成藕,而呈鞭状生长,但在温带地区会根据生长环境进行一定程度的贮藏器官膨大,绿叶期约从5月到11月长达7个月,花期约从6月到11月总长约5个月(张行言2006)。一般情况,莲育种利用藕苫和莲子进行繁殖。莲藕的苫芽萌动在4月份;种子经过处理后,从播种到长根长叶大约需要5~7天;5月中下旬立叶浮出水面;6月中下旬始花期;7、8月份进入盛花期;9月上旬为末花期;果熟期从7月下旬到9月中旬,同时也是地下茎膨大和充实期;9月下旬开始进入叶黄期,10月中旬后进入休眠期;整个生育期大概190天。莲的生活周期因地域而稍有差异,南方气候温和,萌发和开花要早于北方。1.1.3 莲的组学研究和分子生物学研究
在马铃薯块茎发育的通路研究中,以CO-FT通路研究的最为透彻(图1.3)。马铃薯中的研究表明,COL1在StSP5G(S.tuberosum SELF-PRUNING 5G,FT同源基因)的启动子中结合了TGTGGT元素,从而抑制了马铃薯块茎的形成(Abelenda,Cruz-Oro et al.2016)。StCDF1是一种转录调节因子,通过下调StCO表达并激活StSP6A(S.tuberosum SELF-PRUNING 6A,FT同源物)的表达的块茎信号来控制植物的成熟并介导块茎的发生(Kloosterman,Abelenda et al.2013)。该途径的其他成员包括FLAVIN-BINDING,KELCH REPEAT,F-BOX 1(FKF1),GIGANTEA(GI)和CYCLING DOF FACTOR 1(CDF1)蛋白质都参与调节CO的转录。在短日照条件下,拟南芥AtCO表达在夜间达到峰值,而在白天保持低表达;在长日照条件下,蓝光感光体FKF1的积累可增强AtCO的表达(Imaizumi,Tran et al.2003)。在长日照条件,AtCDF1对CO的抑制作用通过与其启动子结合实现,而FKF1蛋白则通过其LOV结构域与CO相互作用,起到稳定CO蛋白的作用(Sawa,Nusinow et al.2007,Song,Smith et al.2012)。在马铃薯(Solanum tuberosum)中,CO基因表达的昼夜振荡与拟南芥中不同。AtCO和Hd1(水稻中的FT同源物)转录水平在黄昏达到峰值,而马铃薯StCOL1在黎明表达峰值(de Montaigu,Rühl et al.2015)。在马铃薯安第斯亚种中过表达AtCO可以延缓短日照条件下马铃薯块茎的形成。在CO-FT通路中,CONSTANS/CONSTANS-like(CO/COL)家族成员担任了非常重要的角色。拟南芥中的CO/COL家族根据其蛋白质结构分为三个亚族,Ⅰ的结构特点是包含2个b-box结构和一个CCT结构由6个保守氨基酸组成(Griffiths,Dunford et al.2003),成员有CO及COL1-COL5;Ⅱ群结构为只含有一个b-box结构,成员有COL6-COL8和COL16;Ⅲ群包含一个b-box,一个次级分叉的锌指蛋白结构,成员有COL9-COL15,三个亚族的所有蛋白质都在C端存在一个CCT结构域(Robson,Costa et al.2001)。CO/COL在拟南芥和水稻中都具有调控开花的作用(Valverde 2011),它的同源基因序列和功能具有高度保守性,各种各样的植物中都存在着CO/COL的同源基因(Khanna and Wu 2009)。COL蛋白在许多植物中都承担着转录激活的功能(Putterill,Robson et al.1995,Tiwari,Shen et al.2010,Chen 2012),有趣的是决定COL蛋白的转录活性的区域既不在b-box上也不在CCT功能域,而是在两个结构之间的谷氨酸富集区。CO主要在叶片中表达并接受光信号,在挪威云杉(Picea abies)中研究表明,针叶中表达量高于根尖(Holefors,Opseth et al.2009)。在蝴蝶兰(Phalaenopsis hybrida)中也有证实COL蛋白在叶片中负责感受光信号(Valverde 2011,Zhang,Wu et al.2011)。在拟南芥CO在长日照下促进拟南芥开花(Robson,Costa et al.2001)。在马铃薯中过表达拟南芥的CO基因,能够抑制马铃薯块茎的膨大,而沉默马铃薯StCO基因,能够促使马铃薯块茎膨大(Navarro,Cruz-Oróet al.2015)。
【参考文献】
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3 李良俊;潘恩超;许超;叶枝荣;曹碚生;;莲藕膨大过程中内源激素、水杨酸和多胺含量的变化[J];园艺学报;2006年05期
4 张行言;王其超;;热带型荷花的发现与荷花品种分类系统[J];中国园林;2006年07期
5 柳俊,谢从华;马铃薯块茎发育机理及其基因表达[J];植物学通报;2001年05期
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7 陈维培;张四美;;莲的根茎构造、伸长与增粗[J];Journal of Integrative Plant Biology;1989年03期
8 陈维培,张四美;莲的生态解剖学研究[J];生态学报;1988年03期
9 陈维培,张四美,严素珍;莲的花部解剖和发育的初步研究[J];南京师大学报(自然科学版);1982年04期
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1 李峰;莲藕根状茎膨大机理初步研究[D];华中农业大学;2008年
本文编号：2882466
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