近些年来,随着奶牛养殖业的不断发展,奶牛的单产水平逐年提升。然而随之也带来了很多问题,其中奶牛产后繁殖力下降最为突出。很多高产奶牛产后出现不发情、发情表现不足或受胎率下降等情况,导致高产牛群后代数量下降,奶牛胎间距增大,养殖企业成本增加利润下降。生殖激素对于调节奶牛发情周期和妊娠具有非常重要的作用,并且一直以来对其调节机制进行了大量研究和应用,但是尽管如此也没有从根本上解决奶牛产后繁殖力下降的问题。奶牛在产后30天开始进入产奶高峰期,而直到产后90天奶牛才开始进入采食高峰期,这一段时期奶牛的能量就处于能量负平衡状态。然而奶牛产后60至90天正是参配的最佳时期。有研究发现,奶牛在泌乳期或营养不足的情况下,steroidogenic acute regulatory protein(St AR)基因的表达被下调。该基因被下调将直接导致卵巢孕酮合成水平下降,如果奶牛此时参配则将导致受胎率下降。这一研究结果提示,某些营养物质可能参与了奶牛产后发情和受孕的调节。低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)一直以来被视为营养物质或类固醇激素合成底物。越来越多的研究证实低密度脂蛋白对孕酮合成具有刺激作用。而低密度脂蛋白调节St AR基因表达的证据仅在小鼠的非卵巢细胞中被发现。然而在颗粒细胞中低密度脂蛋白是否具有类似的调节St AR基因表达的作用仍未有报道。而对这一问题的研究将有助于理解体内卵泡排卵后,低密度脂蛋白在颗粒细胞向黄体细胞分化过程中对其功能转变的作用。本研究在体外培养牛颗粒细胞,利用含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)的DMEM/F12培养液处理颗粒细胞24h后与对照组(未添加低密度脂蛋白)进行比较。利用孕酮放免试剂盒分析两组培养液中的孕酮含量,结果显示低密度脂蛋白组产生的孕酮(155.61±35 ng/105细胞)明显多于对照组(30.31±6.2ng/105细胞;p0.05);荧光定量PCR结果显示,低密度脂蛋白上调了颗粒细胞St AR和P450scc的m RNA表达量,分别比对照组提高2.29和2.33倍(p0.05);利用Western blot技术分析结果显示经低密度脂蛋白处理后,颗粒细胞中St AR蛋白表达水平较未经处理的对照组颗粒细胞提高2.71倍(p0.05);利用油红对两组颗粒细胞进行染色,结果显示经低密度脂蛋白处理的颗粒细胞中积累的脂滴数量为124.3±24.3/细胞,明显多于未经处理的对照组中的脂滴数量(40.6±12/细胞;p0.01);另外,本实验将奶牛发情中期黄体内的黄体细胞(luteal cells,LC)分离出来并原代培养后,使用油红染色并与前两组进行对比,结果显示黄体细胞中脂滴数量(354.1±27.9/细胞,p0.01)明显多于颗粒细胞的对照组和低密度脂蛋白处理组;为了研究溶酶体在这个过程中的变化,我们分别使用了LAMP1免疫荧光染色和吖啶橙活体染色对两组细胞中溶酶体形态进行分析,结果显示LAMP1免疫荧光染色后低密度脂蛋白处理组中的LAMP1荧光强度(0.93±0.02)明显高于对照组(0.57±0.14;p0.05),同样地,吖啶橙(acridine orange,AO)染色也显示低密度脂蛋白处理组中的溶酶体数量(58.2±5.5/细胞)明显多于对照组(25.4±3.0/细胞;p0.05);另外,本实验还对奶牛发情中期黄体中分离得到的黄体细胞在原代培养后,进行LAMP1免疫荧光染色和吖啶橙活体染色,并与前两组进行对比,结果显示黄体细胞中存在着大量的溶酶体,而其无论是LAMP1荧光强度(3.71±0.05)还是吖啶橙活体染色的溶酶体数量(301.7±5.0/细胞),均高于或多于(p0.05)对照组和低密度脂蛋白处理组的颗粒细胞。为了研究溶酶体在低密度脂蛋白诱导的颗粒细胞St AR表达和孕酮合成过程的作用,本实验将培养的细胞分成三组,即对照组、低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)处理组和低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)与氯喹(chloroquine,CQ)(50μmol/L)混合处理组。孕酮检测结果显示,添加低密度脂蛋白和氯喹处理的颗粒细胞所产生的孕酮量(19.2±7.5ng/105细胞)与对照组(27±4.7ng/105细胞)无明显差异(p0.05),但是这两组明显少于只添加低密度脂蛋白处理的颗粒细胞所产生的孕酮量(178.5±9.4ng/105细胞;p0.05);同时,Western blot结果表明当氯喹被添加到培养液中时,低密度脂蛋白对颗粒细胞St AR蛋白质表达的刺激作用受到了明显抑制,即其表达水平明显低于单独添加低密度脂蛋白组(p0.05),而与对照组处于相似水平(p0.05)。另外,为了研究细胞内胆固醇内稳态对溶酶体数量的影响,本实验将培养的颗粒细胞分成两组细胞,向其添加含有60μmol/L胆固醇(Cholesterol)的培养液预处理颗粒细胞1小时,然后分别更换只含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)以及含有低密度脂蛋白(20μg of protein/ml)和胆固醇(60μmol/L)的新鲜培养液继续培养24小时。LAMP1免疫荧光分析显示,与单独添加低密度脂蛋白组的LAMP1的平均荧光密度(0.93±0.02)相比,添加胆固醇和低密度脂蛋白组的LAMP1平均荧光密度(0.39±0.01;p0.05)明显减少;同样地,吖啶橙活体染色结果显示,胆固醇阻止了低密度脂蛋白刺激的溶酶体增多,添加胆固醇和低密度脂蛋白组颗粒细胞中的溶酶体平均数量(34.9±4.29/细胞)明显少于单独添加低密度脂蛋白组(75±8.25/细胞;p0.05)。因此,我们的结果表明,低密度脂蛋白通过上调牛颗粒细胞中St AR的mRNA和蛋白质表达以及P450scc的m RNA表达方式,调控其孕酮合成水平;低密度脂蛋白刺激牛颗粒细胞中产生大量溶酶体,并且这些溶酶体控制着低密度脂蛋白对颗粒细胞St AR蛋白质表达和孕酮合成的调控作用,而这种溶酶体数量的变化受到了颗粒细胞中胆固醇内稳态的调节。
【学位单位】：东北农业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S823
【文章目录】：摘要
英文摘要
1 前言
1.1 孕酮对生殖的作用与生物合成
1.1.1 孕酮对生殖的作用
1.1.2 孕酮的生物合成
1.2 黄体合成孕酮的调控因素
1.2.1 垂体激素的慢性调节
1.2.2 LH的脉冲式释放
1.2.3 雌激素的影响
1.2.4 孕酮分泌的急性调节
1.3 StAR表达调控的研究进展
1.3.1 StAR表达的激素调节
1.3.2 锌指结构转录因子的调节
1.3.3 bZIP转录因子的调节
1.3.4 cAMP-PKA依赖的转录激活
1.3.5 StAR表达的转录抑制
1.4 低密度脂蛋白的摄入与代谢
1.4.1 低密度脂蛋白的结构
1.4.2 低密度脂蛋白的摄入
1.4.3 低密度脂蛋白的代谢
1.5 溶酶体的形成
1.6 研究的目的和意义
2 材料与方法
2.1 实验试剂和仪器
2.1.1 主要试验试剂
2.1.2 主要试验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 牛颗粒细胞原代培养
2.2.2 牛颗粒细胞的处理
2.2.3 黄体细胞的分离与培养
2.2.4 孕酮浓度测定
2.2.5 实时荧光定量PCR
2.2.6 蛋白印迹检测
2.2.7 油红O染色
2.2.8 吖啶橙活细胞染色
2.2.9 免疫荧光染色
2.2.10 统计分析
3 结果
3.1 低密度脂蛋白对牛颗粒细胞孕酮合成和St AR表达的影响
3.2 低密度脂蛋白对牛颗粒细胞中脂滴的影响
3.3 低密度脂蛋白对牛颗粒细胞中溶酶体的影响
3.4 溶酶体对低密度脂蛋白诱导的牛颗粒细胞St AR蛋白表达和孕酮合成的影响
3.5 胆固醇对低密度脂蛋白诱导的牛颗粒细胞溶酶体变化的影响
4 讨论
4.1 低密度脂蛋白促进孕酮合成
4.2 溶酶体与孕酮合成的关系
4.3 颗粒细胞的胆固醇内稳态
4.4 总结
5 结论
致谢
参考文献
攻读博士学位期间发表的学术论文
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本文编号：
2883525
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