黄鳝性逆转相关基因的克隆及其调控机制的研究

发布时间：2017-04-06 07:03

  本文关键词：黄鳝性逆转相关基因的克隆及其调控机制的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：本研究克隆获得了黄鳝wt1、foxl2、dax1和amh基因的全长序列,并分析了它们在黄鳝性腺不同发育时期以及不同组织间的表达差异。序列分析结果发现wt1、foxl2、dax1在不同物种间保守性较高,而amh在不同物种间保守性并不高。18s、ef1α和rpl17为黄鳝性腺发育研究中稳定的内参基因,可以对目的基因进行矫正。半定量研究结果表明,wt1和dax1基因广泛分布在包括性腺在内的多个组织中,说明这两个基因的功能比较复杂。而在性腺、脑和眼中能检测到foxl2的表达,表明该基因参与了鱼类眼部结构的形成和发育。amh只局限在性腺中表达,表明该基因对性腺的发育和分化具有重要作用。实时荧光定量和免疫组织化学研究结果发现,wt1基因在三种性别的性腺中都有表达,且wt1蛋白主要在精巢的支持细胞中表达以及只在卵巢的颗粒细胞中表达,表明该基因不管是对精母细胞的生长以及精子的成熟,还是对卵母细胞的生长和成熟都起到了一定的作用;在雌性卵巢颗粒细胞、间质细胞以及未成熟的卵母细胞中能检测到foxl2蛋白的分布,并且在性腺中的表达量雌性间性雄性,foxl2蛋白也分布在间性性腺和雄性性腺的精巢间质细胞中,表明卵母细胞的发育以及功能的维持需要foxl2的持续表达,且它对雌雄同体鱼类的精巢功能的维持也起到重要的作用。相反,amh基因在性腺中的表达量雄性间性雌性,表明该基因的上调能够启动黄鳝雄性支持细胞的分化,并且对黄鳝雄性的发育和精巢的维持具有一定的作用。dax1不管是在雌性、间性和雄性都有高水平的表达,表明它与黄鳝卵巢的发育以及精巢的发育和维持有关。此外,这些基因也可以通过直接或间接调控cyp19a1a m RNA的表达来调控性腺的发育。本研究测定了HPG轴、HPT轴和HPI轴上相关激素和基因的表达。血清激素测定结果表明,雌二醇(E2)和皮质醇激素在黄鳝性腺发育不同时期没有明显的变化趋势,表明E2和皮质醇对性腺发育的影响可能还受到其受体基因的调控。但三碘甲状腺原氨酸(T3)和游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)在雌性和雄性中表达量很高,但在间性中有显著下降,表明甲状腺激素可能参与黄鳝的性腺发育和性逆转过程的启动。对促性腺激素受体基因的研究显示,fshr和lhr基因在随着黄鳝性腺的发育都有先升高后降低,然后再升高的变化趋势。lhr在产卵前期(雌性V期)表达量达到高峰,而fshr在雄性时期达到高峰,结果表明LH对诱导黄鳝卵母细胞的成熟和排卵有关,且FSH和LH对调节早期精巢的发育,精子的发生以及成熟具有重要作用。star基因的表达模式与fshr类似,表明star基因与黄鳝精巢的早期分化和精子的成熟有关。另外,star基因的表达和fshr基因的表达存在明显的相关性,表明在黄鳝性腺发育过程中,star基因的表达可能受到FSH的调控。在对黄鳝vtg基因的表达模式研究中发现,vtg基因主要在肝脏中表达,特别是在雌性中,说明黄鳝雌性卵母细胞发育过程需要外源性的肝脏合成的卵黄蛋白原。卵巢发育从第III期到第IV期和V期时,vtg基因在肝脏中的表达量显著升高,表明肝脏中卵黄蛋白原基因表达量的升高与卵母细胞卵黄的积累和成熟相关。但随着黄鳝卵母细胞的退化和精巢组织的发育,肝脏中卵黄蛋白原基因表达量显著下降,待进入雄性时期时基本检测不到卵黄蛋白原的表达,表明肝脏卵黄蛋白原合成量的减少有助于卵母细胞的退化和精巢发育的激活。另外,本研究还测定了黄鳝er基因的两个亚型,erα和erβ,以及ar和gr基因在黄鳝性腺不同发育时期肝脏组织和性腺组织中的表达差异。研究表明,erα在肝脏的表达量高于erβ,表明erα比erβ在肝脏卵黄蛋白原的生成调节中具有更重要的作用。erα在肝脏中的表达量随着卵黄的积累以及卵母细胞的成熟逐渐降低,表明E2对雌性黄鳝卵黄的积累的作用可能主要是通过erα来介导的,且随着卵母细胞的成熟,E2诱导卵黄的积累作用减弱。但随着卵母细胞的成熟,vtg的表达量显著性升高,说明卵黄的积累除了受到E2的诱导外还受到其它激素的干扰。在性腺中,erα的表达量随着卵母细胞的成熟逐渐升高,说明性腺卵母细胞的成熟与排卵可能需要一定水平的E2的刺激。当性腺发育进入间性时期,肝脏erα的表达量有所升高,可能是由于黄鳝卵母细胞发育不同步,进入间性时期时仍需要持续的卵黄蛋白原的供应,而性腺中erα的表达量显著降低,表明E2对性腺作用的减退有助于卵母细胞的退化和精巢组织的发育。但雄性性腺中erα也有高水平表达,表明E2也参与了雄性性腺的发育和精巢的维持。ar的表达量在雌性和雄性黄鳝中都是随着卵母细胞和精原细胞的发育与成熟表达量显著升高,表明ar对黄鳝雌性性腺和雄性性腺的发育都起到了一定的作用。gr水平也是随着性腺的发育表达量逐渐升高,特别在雄性性腺中gr的表达量显著升高,表明皮质醇对诱导黄鳝的雄性化具有一定的作用。
【关键词】：黄鳝 性腺发育 性逆转 性别相关基因 血清激素 卵黄蛋白原
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 缩略语表12-13
• 第一章 文献综述13-38
• 1 遗传决定模式（Genetic sex determination，GSD）13-21
• 1.1 鱼类的染色体性别决定类型13-14
• 1.2 鱼类性别决定与分化相关基因14-21
• 2 环境决定模式（Environmental sex determination，ESD）21-25
• 2.1 温度和pH21-22
• 2.2 外源性干扰物22-24
• 2.3 社会地位及行为24-25
• 3 控制性别分化内源激素的研究进展25-32
• 3.1 下丘脑—垂体—性腺轴（HPG）与性腺发育25-29
• 3.2 下丘脑—垂体—甲状腺轴（HPT）与性腺发育29-30
• 3.3 下丘脑—垂体—肾间组织轴（HPI）与性腺发育30-31
• 3.4 三轴之间的相互调控作用31-32
• 4 卵黄蛋白原与性腺发育32-35
• 4.1 卵黄蛋白原的合成32-33
• 4.2 激素与卵黄蛋白原合成33-35
• 5 鱼类性逆转的研究进展35-37
• 6 本研究的目的和意义37-38
• 第二章 黄鳝性腺发育不同时期内参基因稳定性研究38-54
• 1 前言38-39
• 2 材料及方法39-48
• 2.1 实验鱼39
• 2.2 黄鳝组织样品采集39-41
• 2.3 总RNA提取41-42
• 2.4 反转录42-43
• 2.5 引物设计43-44
• 2.6 ef1α 和rpl17 基因的克隆、测序及各基因标准品的构建44-47
• 2.7 实时荧光定量PCR47
• 2.8 数据分析47-48
• 3 结果48-51
• 3.1 Tukey’s HSD检验48-49
• 3.2 Δ~( Ct)比较法49-50
• 3.3 BestKeeper50
• 3.4 GeNorm50-51
• 3.5 NormFind51
• 4 讨论51-53
• 5 小结53-54
• 第三章 黄鳝性逆转过程中foxl2 和wt1 基因的克隆、表达差异以及蛋白定位研究54-74
• 1 前言54-55
• 2 材料及方法55-59
• 2.1 实验鱼55
• 2.2 黄鳝组织样品采集55
• 2.3 总RNA提取55
• 2.4 反转录55
• 2.5 引物设计55-56
• 2.6 wt1 和foxl2 基因的克隆、测序及各基因标准品的构建56-57
• 2.7 序列分析及系统进化树构建57
• 2.8 半定量PCR57-58
• 2.9 实时荧光定量PCR58
• 2.10 免疫组织化学58-59
• 3 结果59-70
• 3.1 Wt1 和Foxl2 cDNA序列的克隆结果及序列分析59-63
• 3.2 wt1 和foxl2 核苷酸序列进化树分析63-64
• 3.3 wt1 基因和foxl2 基因在各组织间的分布64-65
• 3.4 wt1 基因和foxl2 基因在黄鳝性腺不同发育时期的表达差异65-67
• 3.5 免疫组织化学法对Wt1 蛋白和Foxl2 在性腺中的表达进行定位67-70
• 4 讨论70-73
• 5 小结73-74
• 第四章 黄鳝性逆转过程中amh和dax1 基因的克隆、序列分析及其表达差异研究74-90
• 1 前言74-75
• 2 材料方法75-78
• 2.1 实验鱼75
• 2.2 黄鳝组织样品采集75
• 2.3 总RNA提取75
• 2.4 反转录75
• 2.5 引物设计75-76
• 2.6 amh和dax1 基因的克隆、测序及各基因标准品的构建76-77
• 2.7 序列分析及系统进化树构建77
• 2.8 半定量PCR77
• 2.9 实时荧光定量PCR77-78
• 3 结果78-86
• 3.1 Amh和Dax1 cDNA序列的克隆结果及序列分析78-82
• 3.2 amh和dax1 核苷酸序列进化树分析82-83
• 3.3 amh基因和dax1 基因在各组织间的分布83-84
• 3.4 amh基因和dax1 基因在黄鳝性腺不同发育时期的表达差异84-86
• 4 讨论86-88
• 5 小结88-90
• 第五章 黄鳝性逆转过程中fshr、lhr和star基因表达差异以及性腺发育相关激素的测定90-105
• 1 前言90-91
• 2 材料及方法91-95
• 2.1 实验鱼91
• 2.2 黄鳝组织样品及血液的采集91-92
• 2.3 总RNA提取92
• 2.4 反转录92
• 2.5 引物设计92-94
• 2.6 fshr、lhr和srat基因的克隆、测序及各基因标准品的构建94
• 2.7 实时荧光定量PCR94-95
• 2.8 血清激素测定95
• 3 结果95-100
• 3.1 fshr、lhr和srat基因在黄鳝性腺不同发育时期的表达差异95-97
• 3.2 E2、皮质醇、T3和FT3在黄鳝性腺不同发育时期的变化97-100
• 4 讨论100-103
• 5 小结103-105
• 第六章 黄鳝性逆转过程中er、ar和gr基因表达差异与vtg基因表达相关性研究105-117
• 1 前言105-106
• 2 材料及方法106-109
• 2.1 实验鱼106
• 2.2 黄鳝组织样品采集106-107
• 2.3 总RNA提取107
• 2.4 反转录107
• 2.5 引物设计107
• 2.6 er、ar、gr和vtg基因的克隆、测序及各基因标准品的构建107-108
• 2.7 实时荧光定量PCR108-109
• 3 结果109-113
• 3.1 erα 和erβ 基因在黄鳝性腺不同发育时期肝脏和性腺组织中表达差异109-111
• 3.2 ar和gr基因在黄鳝性腺不同发育时期肝脏和性腺组织中表达差异111-112
• 3.3 vtg基因在黄鳝性腺不同发育时期肝脏和性腺组织中的表达差异112-113
• 4 讨论113-116
• 5 小结116-117
• 参考文献117-148
• 附录148-149
• 致谢149-151

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 鲁毅;李任峰;徐萍;李学斌;刘卫;王三虎;;FOXL2与脊椎动物性别决定研究进展[J];河南农业科学;2012年01期

2 张士璀,孙旭彤,李红岩;卵黄蛋白原研究及其进展[J];海洋科学;2002年07期

3 洪万树,方永强;鱼类芳香化酶活性研究的进展[J];水产学报;2000年03期

4 唐永凯;李建林;俞菊华;;奥利亚罗非鱼AMH基因结构及其表达[J];水产学报;2009年03期

5 李兆杰;杨丽君;王静;时文春;刘玉敏;鲁太义;;卵黄蛋白原的研究进展[J];生命科学;2010年03期

6 张艳萍;管慧;宋晶;朱宝长;;WT1在哺乳动物性别发育过程中的调控作用[J];生物技术通报;2006年02期

7 余晶;董晓丽;张颖;刘晓勇;潘鹏;买丽坎;孙大江;;小体鲟AR基因克隆、序列分析及其组织mRNA表达[J];中国水产科学;2014年06期

中国硕士学位论文全文数据库 前6条

1 周玉国;斑马鱼（Danio rerio）繁殖生理机能及其调控研究[D];中国海洋大学;2008年

2 周毅;草鱼（Ctenopharyngodon idellus）促性腺激素及其受体基因的克隆及表达分析[D];湖南师范大学;2009年

3 李加敏;河川沙塘鳢（Odontobutis potamophila）雌鱼性成熟过程中卵黄蛋白原的含量变化及其mRNA的定量研究[D];重庆师范大学;2013年

4 曹玉洁;高白鲑性腺发育的组织学研究及GnRH的分布与克隆[D];石河子大学;2013年

5 朱颖;半滑舌鳎StAR基因的克隆和表达分析及性别相关基因（FTZ-F1、neurl3）原位杂交分析[D];大连海洋大学;2014年

6 蒋小龙;性类固醇激素在尼罗罗非鱼性别决定与分化中的作用[D];西南大学;2014年

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