甜菊苷对金黄色葡萄球菌性乳腺炎模型动物的保护作用及机制研究

发布时间：2017-04-09 09:11

  本文关键词：甜菊苷对金黄色葡萄球菌性乳腺炎模型动物的保护作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：奶牛乳腺炎对奶牛产业发展威胁巨大，不仅造成经济损失，还危害消费者健康。全世界各种类型乳腺炎患病率达到50%。我国是奶牛养殖大国，奶牛乳腺炎危害严重。病原微生物是引起乳腺炎的最主要原因，金黄色葡萄球菌是导致乳腺炎的重要致病菌。金葡菌能反复感染组织，释放的外毒素可引起全身症状，导致奶牛死亡。目前治疗奶牛乳腺炎的主要方法是应用抗生素类药物，但是长时间的抗生素治疗，会使细菌产生抗药性。金葡菌耐药性菌株的产生使得其更加不易治愈。抗生素还会在乳汁中残留，产生药物残留问题。金葡菌感染能引起炎症、细胞凋亡，还能逃避免疫。因此，对金葡菌性乳腺炎的治疗应考虑抗炎、减少细菌诱导的细胞凋亡，增强天然免疫系统的杀菌作用。 抗炎疗法是治疗临床型乳腺炎的重要方法。在应用抗生素杀灭或抑制细菌的同时，应配合抗炎药来控制炎症，减轻剧烈的炎症反应造成的组织损伤。另外减少细胞的死亡和增强机体天然免疫系统的效能也对治疗有重要意义，增强免疫细胞对细菌的杀灭，通过减少细菌数量缓解炎症和细胞死亡的发生。近年来中草药治疗奶牛乳腺炎受到广泛关注。中草药的纯化提取物作为商品化药物制剂也应用于奶牛乳腺炎的治疗。中草药和其提取物可通过其具有的杀菌、抑菌作用，抗炎调节机体免疫的作用，既可单独使用，也可以配合其他药物使用，甚至可以减少抗生素的用量。甜菊苷是从菊科植物甜叶菊的叶子中提取的天然甜味剂，安全性高、无毒副 作用，在美国、欧洲、巴西、韩国、日本和我国，甜菊糖已经被广泛用于食品添加剂。甜菊苷本身具有一些治疗性的功效，例如抗高血糖、抗高血压、抗炎和调节免疫力等。本实验旨在从多方面探索甜菊苷保护性作用的机制。鉴于使用本体动物牛进行动物实验成本过高且不人道，我们使用小鼠建立金葡菌感染乳腺的急性动物模型。通过动物模型实验，采用组织学观察、TUNEL凋亡染色、ELISA、蛋白免疫印迹和荧光定量PCR等方法，研究甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织在病变、炎症和细胞凋亡方面的影响。实验发现，金葡菌感染小鼠乳腺组织后，组织发生炎症，炎性细胞因子分泌量升高，炎性信号通路和凋亡蛋白的活性升高，而甜菊苷在300,100,33mg/kg的浓度下减轻了炎症反应和细胞凋亡，影响了NF κB和MAPK炎性信号通路蛋白和细胞凋亡蛋白的活性。 乳腺上皮细胞是乳腺组织最主要的功能性细胞，，为进一步确证甜菊苷对金葡菌感染细胞的保护作用，我们分离纯化了小鼠乳腺上皮细胞，进行体外细胞实验。先进行甜菊苷孵育后，再给予金葡菌刺激，检测了炎性细胞因子的变化情况和NF κB、MAPK以及凋亡蛋白的变化，发现甜菊苷在300,100,33μg/ml的浓度下抑制了NF κB、MAPK通路的主要蛋白p65、p38等的磷酸化和凋亡蛋白caspase 3、BAX的活化水平，进而减少了炎性细胞因子的分泌。TLR2功能之一就是识别金葡菌，并能够启动和调节下游炎症和细胞凋亡信号。我们探讨了在组织和细胞中甜菊苷对TLR2表达的影响，结果显示，金葡菌感染时甜菊苷抑制了TLR2蛋白和mRNA表达水平，因此，TLR2对下游相关信号的激活也受到影响。细胞实验的结果显示，随着TLR2的过度表达被抑制，其下游炎症相关信号通路NF κB、MAPK和凋亡相关蛋白的磷酸化水平、活化程度也受到抑制，影响了炎症和细胞凋亡的激活。对小鼠乳腺上皮细胞进行活/死细胞染色检验，结果显示甜菊苷通过调节TLR2及其下游信号，减少了细胞死亡数量，起到了保护细胞的作用。另一方面，提高天然免疫系统对细菌的杀灭作用也是控制疾病的途径。为了研究甜菊苷对天然免疫系统的影响，我们检测了甜菊苷和中性粒细胞NETs网的联合作用后细菌生长、炎性因子和相关蛋白的变化。分离纯化了中性粒细胞后，将中性粒细胞生成的NETs网与甜菊苷共同作用于小鼠乳腺上皮细胞，再给予金葡菌刺激，以模拟金葡菌感染时天然免疫系统的部分作用效果。结果表明，甜菊苷和NETs网联合作用时对细菌生长的抑制和对炎症、细胞死亡的抑制效果都强于二者单独作用。这说明甜菊苷对天然免疫系统中性粒细胞NETs网之间具有有协同作用。 综上所述，通过动物实验和体外细胞实验结果表明，甜菊苷对金葡菌感染的乳腺组织具有抗炎和抗凋亡的保护作用，并且能够与NETs网协同，增强乳腺组织免疫力。甜菊苷作为安全无毒的天然甜味剂，在药用价值上有一定的潜力，具有一定的辅助治疗效果。希望本论文研究结果能够为金葡菌性奶牛乳腺炎的临床治疗和抗炎、保健药品的开发提供一定的帮助。
【关键词】：甜菊苷 金黄色葡萄球菌乳腺炎 抗炎 抗凋亡 协同NETs网
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S853.74
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-14
• 英文缩写词表14-16
• 引言16-18
• 第一篇 文献综述18-48
• 第一章 金葡菌性奶牛乳腺炎研究进展18-25
• 1.1 奶牛乳腺炎的危害18-19
• 1.2 奶牛乳腺炎的类型和症状19-21
• 1.3 奶牛乳腺炎的发病因素21-22
• 1.4 金黄色葡萄球菌性奶牛乳腺炎的治疗22-23
• 1.5 奶牛乳腺炎的预防23-25
• 第二章 金黄色葡萄球菌的致病机制25-43
• 2.1 金葡菌感染的特点和危害25-27
• 2.2 金葡菌的毒力因子27-30
• 2.3 金葡菌感染后宿主的免疫应答反应30-34
• 2.4 金葡菌免疫逃避的特点34-36
• 2.5 金葡菌对宿主炎症和凋亡的影响36-43
• 2.5.1 NF-κB 信号通路37-38
• 2.5.2 MAPK 信号通路38-39
• 2.5.3 金葡菌感染后引起宿主细胞的凋亡39-43
• 第三章 甜菊苷研究进展43-48
• 第二篇 研究内容48-100
• 第一章 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织的保护作用48-70
• 1.1 材料49-52
• 1.1.1 实验动物49-50
• 1.1.2 实验菌株50
• 1.1.3 主要试剂和耗材50-51
• 1.1.4 实验仪器设备51
• 1.1.5 溶液和试剂配方51-52
• 1.2 方法52-59
• 1.2.1 小鼠金葡菌性乳腺炎动物模型建立与分组52-53
• 1.2.2 乳腺组织病理组织学观察53
• 1.2.3 乳腺组织 TUNEL 染色观察53-54
• 1.2.4 乳腺组织细胞因子检测54-55
• 1.2.5 乳腺组织总蛋白提取和蛋白表达检测55-58
• 1.2.6 乳腺组织 RNA 提取58
• 1.2.7 乳腺组织荧光定量 PCR 检测58-59
• 1.2.8 数据处理59
• 1.3 结果59-66
• 1.3.1 乳腺病理组织学观察59-60
• 1.3.2 乳腺组织 TUNEL 染色凋亡观察60-61
• 1.3.3 甜菊苷对炎性因子的影响61-62
• 1.3.4 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织 NF-κB 通路 IκBα和 p65的影响62-63
• 1.3.5 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织 MAPK 通路 p38、JNK 和ERK 的影响63-64
• 1.3.6 甜菊苷对健康小鼠乳腺组织 NF-κB 和 MAPK 信号通路影响64-65
• 1.3.7 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织凋亡相关蛋白的影响65-66
• 1.4 讨论66-68
• 1.5 小结68-70
• 第二章 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺上皮细胞的保护作用机制70-86
• 2.1 材料71-72
• 2.1.1 实验动物71
• 2.1.2 实验菌株71
• 2.1.3 化学药品及生物试剂71
• 2.1.4 试剂配制71-72
• 2.2 试验方法72-75
• 2.2.1 细胞模型试验分组72
• 2.2.2 小鼠乳腺上皮细胞的分离纯化步骤72-74
• 2.2.3 小鼠乳腺上皮细胞生化鉴定74
• 2.2.4 甜菊苷对细胞的毒性实验（CCK）74
• 2.2.5 甜菊苷对金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞炎性因子的影响74-75
• 2.2.6 小鼠乳腺上皮细胞总蛋白提取和表达水平检测75
• 2.2.7 小鼠小鼠乳腺上皮细胞总 mRNA 和相关基因表达检测75
• 2.2.8 小鼠乳腺上皮细胞 LIVE/DEAD 死亡检测75
• 2.2.9 数据处理75
• 2.3 结果75-82
• 2.3.1 小鼠乳腺上皮细胞的分离纯化结果75-76
• 2.3.2 甜菊苷细胞毒性细胞生长实验 CKK76
• 2.3.3 甜菊苷对金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞炎性因子的影响76-77
• 2.3.4 甜菊苷对金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞 NF-κB、MAPKs 信号通路 IκBα、p65、p38、ERK 和 JNK 的影响77-79
• 2.3.5 甜菊苷对金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞凋亡蛋白的影响79-80
• 2.3.6 甜菊苷对金葡菌刺激的小鼠乳腺上皮细胞的保护作用80-81
• 2.3.7 甜菊苷对金葡菌感染乳腺和细胞时 TLR2 表达的影响81-82
• 2.4 讨论82-85
• 2.5 小结85-86
• 第三章 甜菊苷与中性粒细胞 NETs 捕网的协同作用86-100
• 3.1 材料87-88
• 3.1.1 实验动物87
• 3.1.2 实验菌株87
• 3.1.3 化学药品及生物试剂87
• 3.1.4 实验仪器设备87-88
• 3.2 方法88-91
• 3.2.1 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织中髓过氧化物酶的影响88
• 3.2.2 中性粒细胞的提取纯化和 NETs 网的诱导生成88-89
• 3.2.3 甜菊苷和 NETs 网对金葡菌生长的影响89-90
• 3.2.4 甜菊苷和 NETs 网对金葡菌引发的炎症的影响90
• 3.2.5 甜菊苷和 NETs 网的联合作用对金葡菌刺激时 NF-κB 和MAPKs 通路蛋白的影响90-91
• 3.2.6 甜菊苷和 NETs 网的联合作用对金葡菌刺激时细胞凋亡蛋白的影响91
• 3.2.7 数据处理91
• 3.3 结果91-96
• 3.3.1 甜菊苷对金葡菌感染的小鼠乳腺组织中髓过氧化物酶（MPO）活性的影响91-92
• 3.3.2 甜菊苷和 NETs 网对金葡菌生长的影响92
• 3.3.3 甜菊苷和 NETs 网对金葡菌引发的炎性因子的影响92-93
• 3.3.4 甜菊苷和 NETs 网的联合作用对金葡菌刺激时乳腺上皮细胞NF-κB、MAPKs 通路 IκBα、p65、p38、ERK 和 JNK 的影响93-95
• 3.3.5 甜菊苷和 NETs 网的联合作用对金葡菌刺激时细胞凋亡蛋白的影响95-96
• 3.4 讨论96-98
• 3.5 小结98-100
• 结论100-101
• 参考文献101-122
• 导师简介122-124
• 作者简介及在学期间所取得的科研成果124-125
• 致谢125

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

1 毛近隆;;天然活性成分甜菊苷化学结构修饰的研究进展[J];北京联合大学学报(自然科学版);2011年01期

2 叶芬;曹杰;魏学良;;奶牛乳房炎防治研究进展[J];中国牛业科学;2007年05期

3 ;NF-κB and Its Regulation on the Immune System[J];Cellular & Molecular Immunology;2004年05期

4 孙传范;李进伟;;甜菊糖苷研究进展[J];食品科学;2010年09期

5 韩超;;规模奶牛场乳房炎防治综合措施[J];中国奶牛;2013年05期

  本文关键词：甜菊苷对金黄色葡萄球菌性乳腺炎模型动物的保护作用及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：294918