牙鲆变态发育中Drosha蛋白与甲状腺激素受体的相互作用及其对microRNA的调控

发布时间：2021-04-11 18:24

　　牙鲆（Paralichthys olivaceus）属于鲽形目牙鲆科,是我国非常重要的海水养殖经济鱼类之一,其典型的胚后变态发育是研究不对称发育机制的良好模型。牙鲆变态发育的主要特征是外部形态上由左右两侧对称的眼睛发生移位到左侧,并且生活方式由浮游性变为伏底性。在这个过程中各组织也发生了重构,其结构与功能发生了变化,这些变化被认为是由于基因的组织特异性表达所致。业已表明,这些基因的组织特异性表达是直接或间接受甲状腺激素的诱导,用外源甲状腺激素处理变态前的牙鲆会导致变态提前发生,而用甲状腺激素抑制剂硫脲处理则可以使变态停滞。在牙鲆变态发育过程中除了甲状腺激素诱导外,micro RNA也发挥着重要的作用。Micro RNA是一类由22个左右的碱基组成的非编码小分子RNA,通常在翻译水平负调控靶基因m RNA的表达。Micro RNA是基因组编码的内源性小分子RNA,需要经过加工才能成为成熟的有功能的Micro RNA。动物mi RNA的加工成熟通常需要Drosha和Dicer两个RNaseⅢ酶的参与。其中Drosha酶主要负责在细胞核内将mi RNA前前体pri-mi RNA切割成前体pr... 

【文章来源】：上海海洋大学上海市

【文章页数】：117 页

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第一章 引言
    1.1 牙鲆变态的分子机制
    1.2 甲状腺激素在牙鲆变态发育过程中的作用
    1.3 Drosha基因在个体发育中的作用
第二章 甲状腺激素对牙鲆Drosha基因表达的影响
    2.1 实验材料与试剂
        2.1.1 样品采集
        2.1.2 主要试剂与仪器
    2.2 实验方法
        2.2.1 牙鲆组织总RNA提取与鉴定
        2.2.2 cDNA第一链的合成
        2.2.3 引物设计
        2.2.4 牙鲆Drosha基因片段克隆
        2.2.5 牙鲆Drosha基因全长克隆
        2.2.6 Drosha基因cDNA小片段、5'RACE和 3'RACE序列拼接
        2.2.7 生物信息学分析
        2.2.8 实时荧光定量分析
    2.3 结果
        2.3.1 牙鲆Drosha cDNA克隆及分析
        2.3.2 .Drosha基因在牙鲆发育过程中的表达分析
    2.4 讨论
        2.4.1 Drosha基因在各组织中的表达
        2.4.2.Drosha基因仔鱼各发育时期的表达
        2.4.3 外源甲状腺激素对Drosha基因表达的影响
第三章 甲状腺激素受体与DROSHA蛋白的相互作用
    3.1 材料与方法
        3.1.1 实验材料
        3.1.2 实验方法
    3.2 结果
    3.3 讨论
        3.3.1 利用免疫共沉淀技术研究THR-Drosha之间的相互作用
        3.3.2 实验的质量控制
        3.3.3 THR和Drosha相互作用调控miRNA的生成
第四章RNA干扰沉默Drosha基因表达
    4.1 材料
    4.2 实验方法
        4.2.1 Drosha-siRNA靶点的选择、设计及合成
        4.2.2 细胞转染
        4.2.3 转染效率的检测
        4.2.4 Realtime-PCR检测Drosha mRNA表达
        4.2.5 Western blot检测Drosha蛋白表达
        4.2.6 siRNA最佳作用浓度的筛选
        4.2.7 siRNA最佳作用时间的筛选
        4.2.8 细胞凋亡检测
        4.2.9 Realtime-PCR检测Drosha下游基因CDKN2A,Cdc42 的表达
        4.2.10 统计学处理
    4.3 结果
        4.3.1 siRNA转染效果检测
        4.3.2 siRNA沉默效果检测
        4.3.3 siRNA最佳浓度的筛选
        4.3.4 siRNA最佳作用时间的筛选
        4.3.5 siRNA转染后细胞凋亡的检测
        4.3.6 Realtime-PCR检测Drosha基因沉默后pri-miRNA和miRNA的表达
        4.3.7 Realtime-PCR检 测Drosha基 因沉默后细胞周期调控基因CDKN2A,Cdc42 mRNA表达
    4.4 讨论
        4.4.1 利用siRNA干扰技术靶向抑制Drosha基因的表达
        4.4.2 牙鲆胚胎细胞中Drosha基因靶向沉默对下游基因的影响
        4.4.3 靶向沉默Drosha基因后导致miRNA表达谱的变化
第五章microRNA靶基因预测及验证
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 实验方法
    5.2 结果
        5.2.1 肌肉相关microRNA靶基因预测及验证
        5.2.2 细胞周期相关靶基因预测及验证
    5.3 讨论
        5.3.1 α-TM在牙鲆组织和发育时期的表达
        5.3.2 牙鲆HDAC4 序列的结构特点
        5.3.3 牙鲆HDAC4 在牙鲆发育过程中的作用
        5.3.4 牙鲆HDAC4 是miR-1 和miR-133a的靶基因
        5.3.5 牙鲆Cdc42 的结构特点及在牙鲆发育过程中的作用
        5.3.6 Cdc42 是miR-17 的靶基因
第六章 总结与展望
参考文献
发表论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]牙鲆中Dicer基因的鉴定与表达[J]. 王古樾,付元帅,施志仪,张俊玲.  海洋渔业. 2013(03)
[2]文昌鱼tropomyosin基因的克隆、进化分析及其胚胎发育与成体中的表达模式[J]. 李忻怡,林浴霜,张红卫.  动物学研究. 2012(04)
[3]外源甲状腺素及可的松对牙鲆早期发育阶段生长、发育和变态的影响[J]. 鲍宝龙,张臻宇,龚小玲,王秀红.  上海水产大学学报. 1999(03)

博士论文
[1]牙鲆变态过程中microRNA的表达及其功能分析[D]. 付元帅.上海海洋大学 2011



本文编号：3131736