猪IgG Fc嵌合PRRSV Nsp9纳米抗体抑制病毒复制的研究

发布时间：2021-04-22 03:42

　　猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的母猪繁殖障碍与呼吸困难、仔猪肺炎、生长迟缓、免疫抑制、死亡率增加等症状的高度传染性疾病,目前缺乏有效的疫苗及商品化的抗病毒药物。Nsp9具有病毒RNA依赖的RNA聚合酶活性,是病毒形成转录和复制复合体的核心组件,可作为研发抗PRRSV制剂的理想靶标。本团队前期已经从骆驼体内筛选出了抗PRRSV Nsp9的纳米抗体Nb6,并验证了胞内表达Nb6的Marc-145细胞系感染PRRSV能力下降;连接细胞穿膜肽TAT的Nb6能够有效进入PRRSV易感细胞,并抑制不同基因型PRRSV复制。然而,细胞穿膜肽穿膜的随机性,提示Nb6靶向易感细胞的入胞途径仍需改进。由于PRRSV具备严格的单核巨噬细胞趋向性,在感染时,首先在猪肺泡巨噬细胞（PAM）中复制。单核巨噬细胞高表达Fcγ受体,该类受体是介导巨噬细胞内吞作用的主要受体。基于以上背景,本研究设计并表达了融合猪Ig G Fc的嵌合抗体Nb6-p Fc,使其能靶向PRRSV易感的猪单核... 

【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：105 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要符号对照表
第一章 文献综述
    1.1 猪繁殖与呼吸综合征研究进展
        1.1.1 PRRSV概述
        1.1.2 PRRSV的感染特点及防控
        1.1.3 抗PRRSV纳米抗体的研发
    1.2 纳米抗体及应用情景
        1.2.1 纳米抗体的结构特点
        1.2.2 纳米抗体的优点
        1.2.3 纳米抗体的应用
    1.3 巨噬细胞FcγR及其介导的内吞作用
        1.3.1 FcγRs的分类
        1.3.2 巨噬细胞的内吞
        1.3.3 FcγR在PRRSV感染上的研究进展
    1.4 本研究的目的及意义
第二章 猪Fcγ链接的嵌合抗体表达及活性验证
    2.1 试验材料
        2.1.1 细胞、质粒与菌株
        2.1.2 主要试剂耗材
        2.1.3 主要仪器设备
    2.2 试验方法
        2.2.1 毕赤酵母表达重组质粒p PICZαA-Nb6-pFc的构建
        2.2.2 阳性Nb6-pFc、Nb53-pFc毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选
        2.2.3 Nb6-pFc在毕赤酵母X-33 中的诱导表达及初步鉴定
        2.2.4 Nb6-pFc的纯化、浓缩及活性鉴定
    2.3 试验结果
        2.3.1 pPICZαA-Nb6-pFc毕赤酵母表达重组质粒的构建
        2.3.2 阳性Nb6-pFc、Nb53-pFc毕赤酵母X-33 表达菌株的筛选
        2.3.3 Nb6-pFc、Nb53-pFc的诱导表达及鉴定
        2.3.4 Nb6-pFc的纯化、浓缩及活性鉴定
    2.4 讨论
    2.5 小结
第三章 Nb6-pFc通过FcγR介导的内吞作用进入细胞
    3.1 试验材料
        3.1.1 细胞和病毒
        3.1.2 主要试剂耗材
        3.1.3 主要仪器设备
    3.2 试验方法
        3.2.1 初步检测Nb6-pFc能够进入含有FcγR的细胞
        3.2.2 不同浓度Nb6-pFc进入PAM检测
        3.2.3 不同时间Nb6-pFc进入PAM检测
        3.2.4 Nb6-pFc的细胞毒性检测
    3.3 试验结果
        3.3.1 IFA检测Nb6-pFc进入PAM和 BMDC细胞
        3.3.2 不同浓度Nb6-pFc进入PAM的检测
        3.3.3 不同时间Nb6-pFc进入PAM的检测
        3.3.4 Nb6-pFc的细胞毒性检测
    3.4 讨论
    3.5 小结
第四章 Nb6-pFc抗 PRRSV功能研究
    4.1 试验材料
        4.1.1 病毒
        4.1.2 主要试剂耗材
        4.1.3 主要仪器设备
    4.2 试验方法
        4.2.1 Nb6-pFc对 rSD16/TRS2/clover在 PAM上复制的影响
        4.2.2 Nb6-pFc对 PRRSV高致病性GD-HD在 PAM上复制的影响
    4.3 试验结果
        4.3.1 Nb6-pFc抑制rSD16/TRS2/clover在 PAM细胞上的复制
        4.3.2 Nb6-pFc抑制GD-HD在 PAM上的复制
        4.3.3 Nb6-pFc引起PAM细胞因子的表达
        4.3.4 Nb6-pFc能够抑制PRRSV不同毒株在PAM上的复制
        4.3.5 Nb6-pFc分多次给药能够提高对rSD16/TRS2/clover在 PAM上的抑制率
    4.4 讨论
    4.5 小结
第五章 稳定表达Nb6-pFc悬浮293细胞系的构建
    5.1 试验材料
        5.1.1 细胞与质粒
        5.1.2 主要试剂耗材
        5.1.3 主要仪器
    5.2 试验方法
        5.2.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表达重组质粒的构建
        5.2.2 慢病毒的包装
        5.2.3 慢病毒的转导293s细胞
        5.2.4 细胞培养上清表达产物的鉴定
        5.2.5 荧光阳性细胞的分选及扩大培养
    5.3 试验结果
        5.3.1 pLvx-sp-Nb6-pFc-IRES-Zs Green表达重组质粒的构建
        5.3.2 慢病毒包装
        5.3.3 293s细胞培养上清中表达的Nb6-pFc具有良好的生物学活性
        5.3.4 分选后Nb6-pFc的293s荧光观察
    5.4 讨论
    5.5 小结
全文结论
创新点及下一步研究方向
参考文献
附录 基本缓冲液配制
致谢
个人简历



本文编号：3153093