线粒体膜通道蛋白VDAC在家榆种子老化过程中的作用机制研究

发布时间：2021-04-23 11:19

　　种子是种质资源保存的重要载体,对延续物种起着重要作用,但种子自成熟后,会发生活力逐渐下降的不可逆过程,我们称之为种子老化。本实验室前期研究发现种子老化过程中存在活性氧（reactive oxygen species,ROS）介导的线粒体途径的细胞程序化死亡（Programmed cell death,PCD）,但具体机制尚不清楚。有文献表明线粒体外膜电压依赖性阴离子通道蛋白（voltage-dependent anionchannel,VDAC）是线粒体途径的PCD中不可缺少的元件,对细胞死亡进程的引发起关键作用。本研究以家榆（Ulmus pumila L.）种子为实验材料,对VDAC在种子老化过程中的作用及其机制开展研究。主要研究内容和结果如下:1.家榆种子老化过程中,伴随ROS爆发,线粒体形态功能均发生变化。ROS供体和抑制剂预处理种子活力检测结果表明,ROS的积累与种子活力的降低之间具有紧密的联系。线粒体特异性荧光探针标记检测发现线粒体在衰老早期的聚集与ROS的产生有关。利用蛋白双向电泳对老化过程中家榆种子线粒体蛋白组进行分析,质谱鉴定发现有37种蛋白,伴随着ROS的爆发和线粒体... 

【文章来源】：北京林业大学北京市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：146 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
主要缩略词
引言
1 文献综述
    1.1 种子老化概述
        1.1.1 种子老化劣变
        1.1.2 种子老化与PCD的关系
    1.2 线粒体介导的细胞死亡
        1.2.1 种子老化过程线粒体的变化
        1.2.2 线粒体途径的PCD
        1.2.3 线粒体外膜通道蛋白VDAC
    1.3 ROS与种子老化关系概述
        1.3.1 ROS介导的PCD
        1.3.2 蛋白氧化修饰
    1.4 GAPDH与细胞死亡
        1.4.1 GAPDH功能多样性
        1.4.2 GAPDH氧化修饰与细胞凋亡
    1.5 金属与氧化
        1.5.1 金属催化的蛋白氧化
        1.5.2 金属胁迫促进GSH合成
    1.6 立题依据与技术路线
2 种子老化过程中ROS引发的线粒体形态及功能变化
    2.1 材料方法
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株与载体
        2.1.3 种子老化及发芽实验
        2.1.4 药理学处理
2O₂含量测定">        2.1.5 H₂O₂含量测定
        2.1.6 ROS及线粒体分布的观察
        2.1.7 线粒体呼吸速率检测
        2.1.8 线粒体纯度检测
        2.1.9 SDS-PAGE凝胶电泳
        2.1.10 蛋白双向电泳
        2.1.11 羰基化检测
        2.1.12 western blotting
        2.1.13 MDH基因片段获得
        2.1.14 原核表达载体构建
        2.1.15 重组蛋白诱导表达及纯化
        2.1.16 MDH酶活测定及离体线粒体NADH摄取速率测定
        2.1.17 统计分析
    2.2 结果与分析
        2.2.1 家榆种子老化过程中ROS水平与种子活力的关系
        2.2.2 ROS对线粒体形态与分布的影响
        2.2.3 老化过程线粒体蛋白差异表达分析
        2.2.4 响应ROS的线粒体蛋白丰度变化分析
        2.2.5 TCA循环蛋白下调导致线粒体呼吸速率降低
        2.2.6 VDAC上调伴随线粒体Cytc释放
        2.2.7 线粒体蛋白的羰基化修饰
        2.2.8 羰基化修饰影响蛋白功能
    2.3 讨论
        2.3.1 ROS引起种子老化过程中线粒体分布和形态的改变
        2.3.2 线粒体抗氧化酶的下调可能导致种子老化过程中ROS爆发
        2.3.3 ROS可能通过破坏TCA循环和ETC影响线粒体呼吸作用
        2.3.4 VDAC可能参与了种子老化过程中线粒体途径的PCD
        2.3.5 羰基化修饰可能影响了老化后期的能量及蛋白质代谢
    2.4 小结
3 谷胱甘肽化修饰介导的GAPDH与VDAC互作参与VDAC通道功能调控
    3.1 材料方法
        3.1.1 植物材料
        3.1.2 菌株与载体
        3.1.3 表达载体构建
        3.1.4 重组蛋白诱导表达纯化及UpGAPDH1体外谷胱甘肽化
        3.1.5 atgapc1和atvdac3突变体及过表达拟南芥筛选鉴定
        3.1.6 GST pull-down
        3.1.7 蛋白双向电泳及质谱测序
        3.1.8 免疫共沉淀
        3.1.9 离体线粒体KC1处理
        3.1.10 原生质体游离
        3.1.11 免疫荧光
        3.1.12 Dot blotting
        3.1.13 石蜡切片
        3.1.14 TUNEL
        3.1.15 Duolink PLA
        3.1.16 金属含量测定
        3.1.17 谷胱甘肽含量测定
        3.1.18 UpGAPDH1氨基酸定点突变
        3.1.19 统计分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 VDAC在种子老化中的作用
        3.2.2 种子老化过程中UpVDAC3互作蛋白筛选
        3.2.3 种子老化过程中GAPDH与VDAC的互作分析
        3.2.4 谷胱甘肽化介导的GAPDH与VDAC互作
        3.2.5 种子老化过程中GAPDH的谷胱甘肽化水平
        3.2.6 GAPDH谷胱甘肽化修饰加速线粒体Cyt c释放及细胞死亡
        3.2.7 种子老化早期GSH含量升高
        3.2.8 Zn促进GSH水平升高
        3.2.9 Zn或GSH促进种子老化依赖VDAC
        3.2.10 Zn和GSH促进线粒体Cytc释放及细胞死亡
        3.2.11 金属离子促进ROS爆发
    3.3 讨论
    3.4 小结
4 金属介导的羰基化修饰参与VDAC功能调控
    4.1 材料方法
        4.1.1 试验材料
        4.1.2 菌株与载体
        4.1.3 UpVDAC3氨基酸定点突变
        4.1.4 重组蛋白诱导表达纯化
        4.1.5 植物表达载体构建及农杆菌转化
        4.1.6 点突变UpVDAC3亚细胞定位分析
        4.1.7 过表达拟南芥获得及筛选
        4.1.8 IMAC金属亲和层析
        4.1.9 pYES2-UpVDAC3载体构建、转化和表达
        4.1.10 酵母DNA提取
        4.1.11 重组融合蛋白检测
        4.1.12 Western-blotting
        4.1.13 UpVDAC3重组蛋白金属处理及羰基化检测
        4.1.14 酵母氧化处理实验
        4.1.15 统计分析
    4.2 结果与分析
        4.2.1 金属结合蛋白可能是种子老化过程羰基化修饰的靶点
        4.2.2 VDAC序列分析及氨基酸定点突变
        4.2.3 点突变VDAC金属结合能力及羰基化修饰敏感性分析
        4.2.4 点突变UpVDAC3亚细胞定位分析
        4.2.5 VDAC羰基化对酵母细胞的影响
        4.2.6 UpVDAC3羰基化修饰在拟南芥种子老化中的作用
        4.2.7 谷胱甘肽化的UpGAPDH1增加UpVDAC3对羰基化修饰的敏感性
    4.3 讨论
    4.4 小结
5 结论
6 讨论
7 展望
参考文献
附录A 引物表
附录B 家榆种子老化过程中差异表达的线粒体蛋白依照分子功能分类表
附录C 具有Binding功能的差异表达线粒体蛋白详细分类表
附录D 金属结合蛋白所能结合金属种类预测表
2+-IMAC捕获金属结合蛋白列表">附录E Cu²⁺-IMAC捕获金属结合蛋白列表
2+-IMAC捕获金属结合蛋白列表">附录F Zn²⁺-IMAC捕获金属结合蛋白列表
2+-IMAC捕获金属结合蛋白列表">附录G Fe²⁺-IMAC捕获金属结合蛋白列表
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导师简介
获得成果目录
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[3]高温加速老化过程中甜菜种子线粒体小分子量热激蛋白22的变化（英文）[J]. 宋松泉,KennethM.Fredlund,IanM.Mller.  植物生理学报. 2001(01)
[4]人工老化过程红松种胚细胞物质外渗和超微结构变化[J]. 赵垦田,李立华.  东北林业大学学报. 2000(03)



本文编号：3155231