抗坏血酸在牦牛卵母细胞和体外受精胚胎DNA甲基化调控中的应用
发布时间：2021-04-23 09:41
牦牛作为青藏高原上的特有物种,对农牧民具有重要的经济价值,但其因为自然繁殖率低,体外受精（IVF）无疑成为解决这一问题的主要手段。然而,牦牛卵母细胞的质量是成功受精以及影响胚胎发育的关键因素。黄曲霉素B1（AFB1）作为饲料中最危险的霉菌毒素,对饲料的污染无法完全避免,且污染后高度稳定。误食因AFB1污染的饲料会导致哺乳动物的生殖毒性,破坏卵母细胞表观遗传修饰和质量,并影响受精。因此,预防和缓解因AFB1诱导的毒性最有效的方法是补充药物或抗氧化剂。抗坏血酸（AA）作为一种抗氧化剂被广泛的应用于细胞培养,并且已被证实是DNA甲基化调节中TET双加氧酶不可替代的辅助因子。然而,AA对牦牛IVF胚胎DNA甲基化调控的作用以及是否能够保护牦牛卵母细胞免受AFB1的毒性影响仍然未知。本实验通过DNA甲基化评估了AA对牦牛植入前胚胎的发育影响,以及AA对暴露在AFB1中卵母细胞的保护作用,旨在阐明其可能发生的具体机制。1.添加不同浓度的AA培养IVF胚胎,统计卵裂率和...
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
SUMMARY
英文缩写词表Ⅰ
英文缩写词表Ⅱ
第一部分 文献综述
第一章 哺乳动物的DNA甲基化
1 DNA甲基化的建立与维持
2 DNA去甲基化
2.1 被动去甲基化机制
2.2 主动去甲基化机制
3 哺乳动物基因组中5mC的分布
4 哺乳动物基因组中5hmC的分布
5 胚胎的DNA甲基化
6 卵母细胞的DNA甲基化
6.1 卵母细胞甲基化分布
6.2 卵母细胞甲基化功能
7 DNA甲基化对基因组的作用
7.1 甲基化对印记基因和X染色体失活的作用
7.2 甲基化对转座子的作用
7.3 甲基化对特异性基因表达的作用
8 小结
第二章 抗坏血酸对DNA甲基化的影响
2+和2OG"> 1 TET双加氧酶与Fe2+和2OG
2 AA是TET双加氧酶的辅助因子
3 AA对DNA去甲基化的作用
4 AA对产后发育的影响
5 AA的有效性变化
6 小结
第三章 黄曲霉素B1对DNA甲基化的影响
1 化学环境与DNA甲基化
1与DNA甲基化"> 2 黄曲霉素B1与DNA甲基化
3 胚胎中ROS的产生
3.1 外源性因素导致的ROS
4 活性氧对胚胎的损伤
5 活性氧的防御系统
5.1 非酶物质与ROS
5.2 酶促防御
5.3 氧化应激的修复
6 体外胚胎技术与ROS
6.1 气体环境
6.2 共培养环境
6.3 温度环境
6.4 培养基中的抗氧化物
6.5 金属螯合物
6.6 巯基化合物
6.7 蛋白质类
6.8 维他命
7 小结
第二部分 实验研究
第一章 不同浓度AA对牦牛IVF胚胎发育的影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养
2.3 囊胚细胞的凋亡染色与计数
2.4 囊胚微量RNA的提取
2.5 反转录（cDNA）
2.6 Real Time PCR引物设计与合成
2.7 Real Time PCR
2.8 统计学分析
3 结果
3.1 不同浓度AA对胚胎发育的影响
3.2 不同浓度AA对囊胚阶段凋亡基因表达的影响
3.3 不同浓度的AA对囊胚细胞凋亡的影响
4 讨论
5 小结
1暴露引起的DNA甲基化异常"> 第二章 抗坏血酸保护牦牛卵母细胞免受黄曲霉素B1暴露引起的DNA甲基化异常
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 AFB1的暴露和AA的添加
2.3 卵母细胞孤雌激活发育能力的评估
2.4 精卵结合能力的评估
2.5 氧化应激检测
2.6 凋亡检测
2.7 线粒体分布评估
2.8 肌动蛋白动力学评估
2.9 卵母细胞的微量RNA提取
2.10 反转录（cDNA）
2.11 Real Time PCR引物设计与合成
2.12 Real Time PCR
2.13 卵母细胞的甲基化染色
2.14 图像分析法
2.15 统计学分析
3 结果
1中卵母细胞的减数分裂成熟"> 3.1 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的减数分裂成熟
1中卵母细胞的孤雌发育能力"> 3.2 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的孤雌发育能力
1中卵母细胞与精子的结合能力"> 3.3 AA提高了暴露在AFB1中卵母细胞与精子的结合能力
1 中卵母细胞的ROS水平"> 3.4 AA降低了暴露在AFB1 中卵母细胞的ROS水平
1中卵母细胞的早期凋亡"> 3.5 AA抑制了暴露在AFB1中卵母细胞的早期凋亡
1中卵母细胞的线粒体分布状态"> 3.6 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的线粒体分布状态
1中卵母细胞的肌动蛋白"> 3.7 AA恢复了暴露在AFB1中卵母细胞的肌动蛋白
1 中卵母细胞的DNA甲基化水平"> 3.8 AA改善了暴露在AFB1 中卵母细胞的DNA甲基化水平
4 讨论
5 小结
第三章 AA对牦牛IVF胚胎发育过程中DNA甲基化的影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养
2.3 囊胚微量RNA的提取
2.4 反转录（cDNA）
2.5 Real Time PCR引物设计与合成
2.6 Real Time PCR
2.7 胚胎的甲基化免疫荧光染色
2.7.1 对不同浓度下各阶段胚胎进行5mC和5hmC的免疫荧光染色分析,具体步骤:
2.7.2 对不同浓度下各阶段胚胎进行TET3的免疫荧光染色分析,具体步骤
2.8 图像分析法
2.9 统计学分析
3 结果
3.1 AA对植入前胚胎DNA甲基化基因表达的影响
3.2 AA对植入前胚胎5mC/5hmC动态表达的影响
3.3 AA对植入前胚胎TET3基因表达的影响
3.4 AA对植入前胚胎TET3动态表达的影响
4 讨论
5 小结
第四章 AA对牦牛IVF囊胚阶段多能性基因启动子区域的甲基化影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养
2.3 囊胚微量RNA的提取
2.4 反转录（cDNA）
2.5 Real Time PCR引物设计与合成
2.6 Real Time PCR
2.7 多能性基因启动子区域的甲基化检测
2.8 统计学分析
3 结果
3.1 AA对囊胚阶段多能性基因表达的影响
3.2 AA对囊胚阶段多能性基因启动子区域甲基化水平的影响
4 讨论
5 小结
全文总结
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表论文和研究成果等
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]Global hypomethylation in hepatocellular carcinoma and its relationship to aflatoxin B1 exposure[J]. Hulya Yazici,Ming-Whei Yu,Po-Huang Lee,Regina M Santella. World Journal of Hepatology. 2012(05)
本文编号：3155095
【文章来源】：甘肃农业大学甘肃省
【文章页数】：113 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
SUMMARY
英文缩写词表Ⅰ
英文缩写词表Ⅱ
第一部分 文献综述
第一章 哺乳动物的DNA甲基化
1 DNA甲基化的建立与维持
2 DNA去甲基化
2.1 被动去甲基化机制
2.2 主动去甲基化机制
3 哺乳动物基因组中5mC的分布
4 哺乳动物基因组中5hmC的分布
5 胚胎的DNA甲基化
6 卵母细胞的DNA甲基化
6.1 卵母细胞甲基化分布
6.2 卵母细胞甲基化功能
7 DNA甲基化对基因组的作用
7.1 甲基化对印记基因和X染色体失活的作用
7.2 甲基化对转座子的作用
7.3 甲基化对特异性基因表达的作用
8 小结
第二章 抗坏血酸对DNA甲基化的影响
2+和2OG"> 1 TET双加氧酶与Fe2+和2OG
2 AA是TET双加氧酶的辅助因子
3 AA对DNA去甲基化的作用
4 AA对产后发育的影响
5 AA的有效性变化
6 小结
第三章 黄曲霉素B1对DNA甲基化的影响
1 化学环境与DNA甲基化
1与DNA甲基化"> 2 黄曲霉素B1与DNA甲基化
3 胚胎中ROS的产生
3.1 外源性因素导致的ROS
4 活性氧对胚胎的损伤
5 活性氧的防御系统
5.1 非酶物质与ROS
5.2 酶促防御
5.3 氧化应激的修复
6 体外胚胎技术与ROS
6.1 气体环境
6.2 共培养环境
6.3 温度环境
6.4 培养基中的抗氧化物
6.5 金属螯合物
6.6 巯基化合物
6.7 蛋白质类
6.8 维他命
7 小结
第二部分 实验研究
第一章 不同浓度AA对牦牛IVF胚胎发育的影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞的体外受精和胚胎培养
2.3 囊胚细胞的凋亡染色与计数
2.4 囊胚微量RNA的提取
2.5 反转录（cDNA）
2.6 Real Time PCR引物设计与合成
2.7 Real Time PCR
2.8 统计学分析
3 结果
3.1 不同浓度AA对胚胎发育的影响
3.2 不同浓度AA对囊胚阶段凋亡基因表达的影响
3.3 不同浓度的AA对囊胚细胞凋亡的影响
4 讨论
5 小结
1暴露引起的DNA甲基化异常"> 第二章 抗坏血酸保护牦牛卵母细胞免受黄曲霉素B1暴露引起的DNA甲基化异常
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 AFB1的暴露和AA的添加
2.3 卵母细胞孤雌激活发育能力的评估
2.4 精卵结合能力的评估
2.5 氧化应激检测
2.6 凋亡检测
2.7 线粒体分布评估
2.8 肌动蛋白动力学评估
2.9 卵母细胞的微量RNA提取
2.10 反转录（cDNA）
2.11 Real Time PCR引物设计与合成
2.12 Real Time PCR
2.13 卵母细胞的甲基化染色
2.14 图像分析法
2.15 统计学分析
3 结果
1中卵母细胞的减数分裂成熟"> 3.1 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的减数分裂成熟
1中卵母细胞的孤雌发育能力"> 3.2 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的孤雌发育能力
1中卵母细胞与精子的结合能力"> 3.3 AA提高了暴露在AFB1中卵母细胞与精子的结合能力
1 中卵母细胞的ROS水平"> 3.4 AA降低了暴露在AFB1 中卵母细胞的ROS水平
1中卵母细胞的早期凋亡"> 3.5 AA抑制了暴露在AFB1中卵母细胞的早期凋亡
1中卵母细胞的线粒体分布状态"> 3.6 AA改善了暴露在AFB1中卵母细胞的线粒体分布状态
1中卵母细胞的肌动蛋白"> 3.7 AA恢复了暴露在AFB1中卵母细胞的肌动蛋白
1 中卵母细胞的DNA甲基化水平"> 3.8 AA改善了暴露在AFB1 中卵母细胞的DNA甲基化水平
4 讨论
5 小结
第三章 AA对牦牛IVF胚胎发育过程中DNA甲基化的影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养
2.3 囊胚微量RNA的提取
2.4 反转录（cDNA）
2.5 Real Time PCR引物设计与合成
2.6 Real Time PCR
2.7 胚胎的甲基化免疫荧光染色
2.7.1 对不同浓度下各阶段胚胎进行5mC和5hmC的免疫荧光染色分析,具体步骤:
2.7.2 对不同浓度下各阶段胚胎进行TET3的免疫荧光染色分析,具体步骤
2.8 图像分析法
2.9 统计学分析
3 结果
3.1 AA对植入前胚胎DNA甲基化基因表达的影响
3.2 AA对植入前胚胎5mC/5hmC动态表达的影响
3.3 AA对植入前胚胎TET3基因表达的影响
3.4 AA对植入前胚胎TET3动态表达的影响
4 讨论
5 小结
第四章 AA对牦牛IVF囊胚阶段多能性基因启动子区域的甲基化影响
1 材料与试剂
1.1 实验样品
1.2 主要仪器
1.3 主要耗材
1.4 主要试剂
2 试验方法
2.1 收集牦牛卵母细胞和成熟培养
2.2 牦牛卵母细胞体外受精和体外培养
2.3 囊胚微量RNA的提取
2.4 反转录（cDNA）
2.5 Real Time PCR引物设计与合成
2.6 Real Time PCR
2.7 多能性基因启动子区域的甲基化检测
2.8 统计学分析
3 结果
3.1 AA对囊胚阶段多能性基因表达的影响
3.2 AA对囊胚阶段多能性基因启动子区域甲基化水平的影响
4 讨论
5 小结
全文总结
参考文献
致谢
作者简介
在读期间发表论文和研究成果等
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]Global hypomethylation in hepatocellular carcinoma and its relationship to aflatoxin B1 exposure[J]. Hulya Yazici,Ming-Whei Yu,Po-Huang Lee,Regina M Santella. World Journal of Hepatology. 2012(05)
本文编号：3155095
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3155095.html
