基于组学的奉节晚橙晚熟变异分子机理研究

发布时间：2017-04-19 21:18

  本文关键词：基于组学的奉节晚橙晚熟变异分子机理研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：拓宽柑橘成熟时期是我国柑橘产业当前的迫切需求,延长鲜果供应期,可大力提高我国柑橘产业的竞争力。柑橘属于非跃变型果实,其果实发育和成熟调控机制依然不清楚,因此研究柑橘果实成熟分子调控机理具有重要的理论和应用意义。本研究以‘奉节72-1’脐橙(Citrus sinensis[L.]Osbeck)及其晚熟突变体‘奉节晚橙’为研究材料,从转录水平、蛋白质水平和转录后水平研究了这一对材料在果实成熟时期的差异。主要研究结果如下:1.‘奉节72-1’(WT)及其晚熟突变体‘奉节晚橙’(MT)果实采收于5个不同成熟时期,即150、170、190、210和240 DAF(花后天数,Days after flowering)。本研究测定了WT和MT在5个不同成熟时期果肉脱落酸(ABA)、可溶性糖和有机酸的含量以及果皮叶绿素含量。通过对生理数据的比较分析,发现170 DAF是MT和WT成熟趋势发生差异的起始点,因此本研究选择170、190和210 DAF三个连续的发育时期作为重点研究对象,同时ABA在MT和WT之间的差异可能对MT晚熟性状的形成有着重要的作用。2.为了高效和全面的比较分析奉节72-1和奉节晚橙在转录水平和蛋白质水平的差异,本研究采用RNA-seq技术比较分析了MT和WT在170、190和210 DAF三个时期的转录表达差异;在蛋白质水平上,采用i TRAQ技术比较分析了MT和WT在这三个时期的蛋白质丰度差异。在转录水平,采用P value0.05、FDR≤0.001且差异倍数大于两倍的条件筛选到628个差异表达基因,其中在170、190和210 DAF三个时期分别筛选到352、270和90个差异基因,三个时期中,在MT中下调表达的基因数量大大多于上调表达的基因数量;通过KEGG代谢通路富集分析,这些差异基因被富集分布于54条不同的代谢通路(每条通路包含3个以上差异表达基因),其中在植物激素信号转导路径富集的差异基因数量是最多的,在170 DAF达到16个,其中差异最大是ABA和乙烯生物合成及信号转导途径,其次还有淀粉与蔗糖代谢途径、类胡萝卜素合成代谢途径等与成熟相关的路径上也富集了不少差异基因。在蛋白质水平,采用i TRAQ技术在MT和WT之间鉴定到130个差异蛋白质(1.5倍以上),一些差异蛋白主要参与细胞壁代谢和柠檬酸代谢,其中还有大量的热击蛋白。通过转录组和蛋白质组的关联分析,发现大部分transcript-protein点落在无显著差异象限,在转录水平或蛋白质水平有差异的基因在转录水平的表达与蛋白质水平表达的相关性比较低,甚至有些基因在这两个水平出现表达相反的趋势,所以这说明转录后水平或翻译后水平调控影响是比较大的,因此综合转录组和蛋白质组进行系统研究是非常有必要的,这样可以更加全面和深入的了解分子调控网路。3.本研究在转录组数据的基础上,鉴定出了大量可能参与果实成熟调控的转录因子,一共从MT和WT中鉴定到159个转录因子(TFs),其中52个TFs在MT和WT之间差异表达,在WT和MT果实成熟过程中分别鉴定到92个和120个差异表达TFs,通过韦恩图分析,鉴定到在以上三个TFs集合中都有的16个TFs。这些转录因子主要分布于C2H2、Dof、b HLH,、ERF、MYB、NAC和LBD转录因子家族,其中ERF家族转录因子在MT和WT之间是差异最多一类转录因子。通过WGCNA(加权关联分析工具)分析,发现了一些与ABA、柠檬酸、果糖、葡萄糖和蔗糖相关性非常高的重要TFs,比如RD26、NTT、GATA7和MYB21/62/77等。采用层次聚类分析MT和WT之间差异表达的52个TFs,结合q RT-PCR分析了16个候选TFs在MT和WT中五个果实成熟时期的表达情况,进一步验证了这些TFs在果实成熟过程中的重要性。4.通过对MT和WT在170 DAF时期的small RNAs及降解组的分析,一共鉴定到107个已知mi RNAs,大部分都在其他物种很保守,此外还鉴定到21个新的mi RNAs,大部分的新mi RNAs的表达量并不低,其中在MT和WT之间差异表达的已知mi RNAs有16个,新mi RNAs有8个。采用降解组测序,鉴定出了225个mi RNAs的靶基因,这些靶基因中SPL类基因和SCL类基因占多数。靶定SPL基因的mi R156、mi R156k及mi R157a,靶定SCL基因的mi RNAs(csi-mi RN19)以及靶定GAMYB的mi R159都可能是柑橘果实成熟调控的关键因子。此外,在本研究中,还鉴定到了66个PHAS基因以及9个tasi RNAs,并且一个tasi RNA可以靶定多个PHAS基因从而产生大量的phasi RNAs;结合转录组数据,分析了mi RNAs表达水平与其靶基因转录水平的相关性,发现线性关系非常差,结合后期的靶基因预测及PHAS基因的分析,这种关系的体现是必然的。总而言之,mi RNAs在转录后水平对基因表达的调控是非常强大的。
【关键词】：脐橙 晚熟突变体 果实成熟 转录组 蛋白质组 small RNA 降解组
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S666.4
【目录】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 缩略词表13-15
• 第一章 文献综述15-37
• 1 课题的提出15-16
• 2 果实成熟调控研究进展16-29
• 2.1 果实成熟类型16-17
• 2.2 果实成熟调控相关因素17-29
• 3 柑橘芽变发掘与利用29-31
• 3.1 芽变及其在柑橘中的利用状况29
• 3.2 柑橘芽变研究进展29-30
• 3.3 柑橘熟期突变体的研究进展30-31
• 4 果实成熟分子机理研究技术及其在柑橘上的应用31-35
• 4.1 转录组学31-32
• 4.2 蛋白质组学32-34
• 4.3 Small RNA组和降解组学34-35
• 5 本研究的目的及内容35-37
• 5.1 研究目的和意义35-36
• 5.2 研究内容和技术路线36-37
• 第二章 脐橙晚熟突变体及其野生型转录组与蛋白质组分析37-80
• 1 前言37-39
• 2 材料与方法39-48
• 2.1 材料39
• 2.2 方法39-48
• 3 结果与分析48-73
• 3.1 MT和WT在果实成熟过程中可溶性糖、有机酸和叶绿素的变化48-51
• 3.2 RNA-seq数据分析51-64
• 3.3 柑橘果实成熟过程中内源ABA水平对ABA、乙烯生物合成及信号转导相关基因的转录调控64-67
• 3.4 蛋白质组分析67-71
• 3.5 转录组和蛋白质组关联分析71-73
• 4 讨论73-80
• 4.1 ABA在果实成熟过程中的调控作用75-76
• 4.2 乙烯在果实成熟过程中的调控作用76-77
• 4.3 糖对果实成熟的调控77
• 4.4 细胞壁代谢途径在果实成熟过程中变化77-78
• 4.5 果实成熟过程中其他的调控因子78-80
• 第三章 柑橘果实成熟过程中重要转录因子的鉴定80-98
• 1 前言80-82
• 2 材料与方法82-83
• 2.1 转录因子的分离、鉴定和分析82
• 2.2 基因网络构建82-83
• 2.3 RNA提取及qRT-PCR分析83
• 3 结果与分析83-94
• 3.1 果实成熟过程中差异表达转录因子鉴定83-87
• 3.2 采用WGCNA进行共表达网络分析87-91
• 3.3 MT和WT之间差异表达转录因子分析91-92
• 3.4 候选转录因子表达分析92-94
• 4 讨论94-98
• 第四章 脐橙晚熟突变体及其野生型microRNA及降解组分析98-118
• 1 前言98-100
• 2 材料与方法100-103
• 2.1 材料和RNA提取100
• 2.2 Small RNA和降解组文库构建及测序100-101
• 2.3 测序数据生物信息学分析101-102
• 2.4 已知miRNAs和新miRNAs鉴定及差异分析102-103
• 2.5 TasiRNA预测103
• 3 结果与分析103-115
• 3.1 sRNAs测序及数据总结103-104
• 3.2 降解组测序及数据总结104-105
• 3.3 MT和WT中已知miRNAs鉴定及表达分析105-107
• 3.4 MT和WT中新miRNAs鉴定及表达分析107
• 3.5 已知miRNA及新miRNA靶基因预测107-113
• 3.6 PHAS基因及tasiRNAs鉴定113-115
• 4 讨论115-118
• 第五章 总讨论118-121
• 参考文献121-142
• 附录Ⅰ MT和WT之间差异表达基因集合142-168
• 附录Ⅱ 在 170、190 和 210 DAF三个时期多于3个在MT和WT之间差异表达基因的KEGG代谢途径168-170
• 附录Ⅲ 在三个发育时期MT和WT中差异表达蛋白170-176
• 附录Ⅳ 已知mi RNAs表达量、序列、pre-miRNA及MT与WT之间差异表达分析176-181
• 附录Ⅴ 已知miRNAs二级结构181-183
• 附录Ⅵ 新miRNAs二级结构183-184
• 附录Ⅶ WT两个生物学重复预测phasiRNA总结184-188
• 附录Ⅷ MT两个生物学重复预测phasiRNA总结188-193
• 附录Ⅸ 攻读博士期间发表论文193-195
• 致谢195-197

【参考文献】

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本文编号：317145