miRNAs对断奶仔猪大肠杆菌抗性的调控作用及机制分析

发布时间：2017-04-19 19:06

  本文关键词：miRNAs对断奶仔猪大肠杆菌抗性的调控作用及机制分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：断奶仔猪腹泻和水肿病是导致断奶仔猪死亡的重要传染性疾病,对养猪业造成了巨大的经济损失,E.coli F18菌株是引起这两种疾病的主要病原菌。由于中国地方猪种抗E. coliF18分子机制尚不清楚,本研究从microRNA及其靶基因的调控作用入手,首先基于课题组前期在苏太猪(具有太湖猪和杜洛克血统的培育品种)F18大肠杆菌抗性型和敏感型个体microRNA测序筛选出的重要的]microRNA-miR-192,利用靶基因预测、qPCR、双荧光素酶报告检测、细胞水平的细菌感染刺激、TALEN敲除以及microRNA前体SNP检测等一系列基因功能验证技术,系统分析miR-192及其靶基因的作用,以期进一步揭示microRNAs在断奶仔猪F18大肠杆菌抗性的调控机制。主要试验结果如下：(1)一种高效准确的大肠杆菌对肠上皮细胞黏附水平的检测方法有助于大肠杆菌抗性相关miRNA及其靶基因的功能研究,本研究应用实时荧光定量PCR方法,以大肠杆菌F18ab、F18ac和K88ac菌毛蛋白基因和猪β-ACTIN基因设计定量PCR引物,以大肠杆菌和猪肠上皮细胞系(IPEC-J2)总DNA为模板进行相对定量PCR检测,利用2-△△Ct计算不同细胞培养面积孔板中细菌相对细胞黏附数量。结果显示,6孔板、12孔板和24孔板培养面积的猪肠上皮细胞分别对F18ab、F18ac口K88ac大肠杆菌的相对黏附数量均差异不显著,大肠杆菌相对黏附数量不受细胞培养数量的影响,结果表明所建立的方法能够准确检测大肠杆菌相对黏附数量,为本研究中大肠杆菌黏附相关实验提供了便捷可靠的检测方法。(2)miR-192靶基因的生物信息分析结合前期表达谱芯片结果,获得5个重要的靶基因,分别是DLG5、ALCAM、FRMD4B、MIPOL1和ZFHX3,结合基因生物学功能和文献挖掘的结果,将ALCAM和DLG5基因确定为关键靶基因进行相关功能研究。通过构建关键靶基因非编码区的荧光素酶报告重组载体,与miRNA模拟物(mimics)共转染293细胞,在细胞水平分析验证miR-192对于关键靶基因的靶向作用,荧光素酶活性检测结果显示,miR-192 mimics对ALCAM和DLG5基因均表现为抑制作用(P0.05)。(3)关键靶基因ALCAM和DLG5的表达谱分析结果表明,DLG5基因在苏太猪35日龄断奶仔猪抗性型和敏感型个体的空肠、十二指肠、肝脏、肺、肾等组织中高度表达,抗性型个体的相对表达量高于敏感型个体,且在心脏和淋巴组织中达到显著水平(P0.05),在所有组织中抗性型和敏感型个体表达水平的差异倍数为1,04%6,464；ALCAM基因在苏太猪的肝脏、肺、肾组织中高度表达,在胃、淋巴、十二指肠和空肠组织中度表达,在其他组织中表达量相对较低,且抗性型和敏感型个体各组织组间差异均不显著。在苏太猪从初生到断奶不同发育时期(8日龄、18日龄、28目龄和35日龄)的表达差异分析结果表明,DLG5基因在肌肉、肺脏及免疫(胸腺、淋巴和脾脏)等组织中随日龄增加表达降低,十二指肠和空肠组织中在28日龄的表达量降至最低,35日龄时呈上升趋势。ALCAM基因28日龄肾脏组织中表达量显著高于8日龄(P0.05)；28日龄和35日龄十二指肠组织的表达量显著低于18日龄,呈下调趋势(P0.05)。(4)在猪小肠上皮细胞系IPEC-J2中分析F18ab、F18ac和K88ac侵袭对miR-192及其关键靶基因表达的影响,细菌刺激未对miR-192的转录水平产生显著影响,细菌培养上清刺激也没有引起miR-192转录水平的显著变化,且不随刺激时间表现出变化趋势；细菌刺激引起了DLG5和ALCAM基因转录水平显著下调(P0.05),细菌培养上清刺激也能引起DLG5和ALCAM基因转录水平下调,且随着刺激时间的延长,DLG5和ALCAM基因的转录水平表达呈显著下调趋势(P0.05)。(5)利用TALEN载体介导敲除IPEC-J2细胞miR-192成熟体,获得miR-192成熟体序列缺失的细胞株,对细胞株中重要靶基因表达水平的检测结果表明,miR-192敲除细胞和对照组的DLG5、ALCAM, FRMD4B的表达水平差异不显著,而MIPOL1和ZFHX3在敲除细胞中的表达水平表现为显著下调(P0.05),大肠杆菌黏附水平检测结果显示,miR-192敲除细胞对大肠杆菌F18ab、F18ac和K88ac的黏附能力均表现为显著上升(P0.05)。鉴于苏太猪同时具有外来品种和中国地方猪品种的遗传基础,关于苏太猪microRNAs的研究并不能完全代表和揭示中国地方猪品种断奶仔猪F18大肠杆菌抗性的调控机制。因此,本研究又以中国地方猪品种梅山猪为研究对象,利用E. coli F18菌株对梅山断奶仔猪进行大肠杆菌感染试验,并通过细菌数量检测、小肠上皮细胞体外黏附及病理检测等一系列试验对大肠杆菌感染试验的表型结果进行系统的验证,获得了确证的E.coli F18抗性型和敏感型个体,然后利用Selex高通量测序,筛选梅山猪断奶仔猪抗性型和敏感型个体间差异microRNAs,通过靶基因预测、网络互作图构建等生物信息学手段,结合课题组前期转录组测序结果,筛选出重要的靶基因及其调控通路,同时利用RNAi技术和细菌感染在细胞水平上进一步验证重要靶基因及其通路基因对大肠杆菌感染的调控作用,探讨中国地方断奶仔猪F18大肠杆菌抗性相关的microRNA分子及其关键靶基因的功能及其调控机制。主要试验结果如下：(1)对苏太猪中发挥重要调控作用的miR-192在梅山猪中进行初步的功能分析验证,组织表达谱结果显示,miR-192在十二指肠和空肠组织中均具有较高水平的表达,肝和肾中度表达,在心、脾、肺、胃、肌肉、胸腺和淋巴中表达量较低。结合前期梅山猪断奶仔猪大肠杆菌试验的结果,大肠杆菌处理没有造成十二指肠和空肠组织中miR-192表达水平的显著性变化,miR-192可能并没有在梅山猪断奶仔猪大肠杆菌感染过程中发挥重要的调控作用。(2)利用前期通过大肠杆菌感染试验和一系列验证获得的确证的梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体,对其十二指肠组织进行microRNA高通量测序分析,获得梅山猪抗性型和敏感型全同胞个体差异miRNAs 24个,其中上调15个,下调9个；通过qPCR方法检测验证miRNAs的差异倍数,发现其与高通量筛选结果具有较高的一致性；结合课题组前期梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体的转录组结果以及差异miRNAs的实验验证结果,并通过靶基因互作网络的分析,将miR-7136-5p及其靶基因MyD88基因确定为关键microRNA和关键靶基因,鉴于MyD88是TLRs/IL-1R信号通路中重要的接头蛋白,将其所在TLR4信号通路作为本试验重点研究的关键调控通路,分析其在大肠杆菌感染中的作用及其机制。(3)F18ac和K88ac菌体刺激后,猪小肠上皮细胞系IPEC-J2的MyD88转录水平显著下调,其所在的TLR4通路中TNFa基因转录水平极显著上调(P0.01)。细菌培养液上清刺激后,MyD88基因在8小时后急剧下调,：TNFa基因转录水平显著上调(P0.05)。受大肠杆菌F18ac和K88ac刺激后,PK15细胞的MyD88同样显著下调(P0.05); F18ac使TLR4通路中CD14基因的表达极显著上调(P0.01),而K88ac的刺激未显著改变其表达;IFN-a表达变化不显著,K88ac刺激使TLR4通路中IL-1β和TLR4基因轻度上调,jTNF-a基因水平极显著上调(P0.01)。细菌培养上清液同样使PK15细胞MyD88基因整体表现下调；CD14基因整体为下调；IFN-a表现为下调；IL-1β和TLR4基因整体趋势为上调；F18ac上清处理组TNF-a表现为极显著水平的上调(P0.01),而K88ac上清处理组TNF-a未表现出上调趋势。(4)利用RNAi技术获得干扰猪MyD88基因效率最高的shRNA表达载体,将其包装成慢病毒载体,用于建立MyD88基因稳定沉默的细胞系,最终获得MyD88基因的干扰效率分别为69.3%、61.0%的IPEC-J2和PK15细胞。MyD88基因的下调造成PK15细胞TLR4和1L-1β基因表达水平显著下调(P0.05),而CD14、IFN-a和TNF-a基因表达水平未发生显著变化。RNAi MyD88基因未对细胞培养液上清中细胞因子IL-1β和TNF-a的水平造成显著影响。(5)MyD88基因稳定沉默的PK15细胞系受大肠杆菌F18ac和K88ac刺激后,MyD88基因仍表现为下调表达,并且干扰组PK15细胞的TLR4和IL-1β基因变化趋势大于对照组；CD14基因变化趋势小于对照组,TNF-a基因变化趋势与对照组相似,IFN-a表现出了显著下调的变化(P0.05)。受大肠杆菌培养上清刺激后,干扰组PK15细胞的TLR4、CD14、 MyD88、IL-1β、IFN-a变化趋势与对照组相似,而干扰组PK15的TNF-a变化趋势小于对照组。对细胞培养液中细胞因子IL-1β和TNF-a检测结果显示,大肠杆菌F18ac和K88ac菌体刺激均使IL-1β水平极显著增高(P0.01),且干扰组上调趋势大于对照组；K88ac培养上清液刺激使IL-1β显著增高(P0.05),且干扰组和对照组趋势相似。F18ac和K88ac菌体和培养上清液刺激均未对干扰组细胞培养液中TNF-a水平产生显著影响。本研究结果表明,microRNA在苏太猪和梅山猪断奶仔猪大肠杆菌感染过程中均发挥了重要的调控作用,而且进一步提示梅山猪(中国地方猪品种)和苏太猪(含有外来猪品种血统的培育品种)在大肠杆菌病抗性的遗传基础和调控机制方面确实存在差异。miR-192靶向作用DLG5和ALCAM基因在苏太猪断奶仔猪应对大肠杆菌侵袭、维持肠道稳定、免疫调控等方面发挥了重要的调控作用, miR-7136-5p靶向作用MyD88基因进而影响TLR4通路在梅山猪断奶仔猪应对大肠杆菌侵袭和免疫应答等方面发挥了重要的调控作用。
【关键词】：猪 miRNAs 靶基因 调控机制 大肠杆菌
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S858.28
【目录】：

• 摘要7-11
• ABSTRACT11-16
• 符号说明16-18
• 主要仪器设备18-19
• 主要数据库及网址19-20
• 第一章 综述20-27
• 1 仔猪腹泻与E.coli F18致病机理20-21
• 2 E.coli F18抗性相关的分子研究21-22
• 3 microRNA及其调控作用22-24
• 4 基因修饰技术24-25
• 5 本研究的目的和意义25-27
• 第二章 miRNA192及其靶基因对苏太断奶仔猪大肠杆菌抗性的作用分析27-70
• 第一节 基于定量PCR技术检测大肠杆菌黏附水平方法的建立27-34
• 1 材料方法27-29
• 1.1 材料27-28
• 1.2 引物设计及PCR扩增28
• 1.3 实时荧光定量标准曲线的制定28
• 1.4 大肠杆菌黏附肠上皮细胞及DNA提取28-29
• 1.5 数据分析29
• 2 结果与分析29-32
• 2.1 PCR扩增产物鉴定29-30
• 2.2 标准曲线30
• 2.3 定量检测细菌相对黏附及数据分析30-32
• 3 讨论32-34
• 第二节 miRNA192靶基因预测及其关键靶基因的靶向验证34-45
• 1 材料与方法34-36
• 1.1 试验材料34
• 1.2 miR-192在不同物种中的保守性分析34
• 1.3 miR-192靶基因预测及功能分析34-35
• 1.4 E.coli F18大肠杆菌抗性相关的靶基因筛选及功能分析35
• 1.5 靶基因3'-UTR靶点区域的oligos序列合成35
• 1.6 双荧光素酶报告载体的构建35-36
• 1.7 细胞转染36
• 1.8 双荧光素酶活性检测36
• 2 结果与分析36-42
• 2.1 miR-192保守性36-37
• 2.2 猪miR-192靶基因预测及功能37-40
• 2.3 E.coli F18大肠杆菌感染相关的靶基因筛选40
• 2.4 ALCAM和DLG5基因3'-UTR双荧光素酶报告载体40-41
• 2.5 荧光素酶报告基因活性检测41-42
• 3 讨论42-45
• 第三节 关键靶基因(DLG5、ALCAM)的差异表达分析45-52
• 1 材料与方法45-47
• 1.1 试验动物45-46
• 1.2 试剂46
• 1.3 荧光定量引物设计与合成46
• 1.4 总RNA抽提及Real-time PCR反应46
• 1.5 数据分析46-47
• 2 结果47-49
• 2.1 荧光定量引物PCR验证情况47
• 2.2 DLG5和ALCAM基因在苏太猪大肠杆菌抗性敏感群体间的表达47-48
• 2.3 DLG5和ALCAM基因在苏太猪不同日龄个体中的表达48-49
• 3 讨论49-52
• 第四节 大肠杆菌侵染对miR-192及其关键靶基因转录水平的影响52-56
• 1 材料与方法52-53
• 1.1 试验材料52
• 1.2 大肠杆菌及培养上清液侵染IPEC-J2细胞52-53
• 1.3 miR-192反转录和定量检测53
• 1.4 靶基因转录水平的检测53
• 2 结果与分析53-54
• 2.1 大肠杆菌侵染对IPEC-J2细胞中miR-192的影响53-54
• 2.2 关键靶基因表达54
• 3 讨论54-56
• 第五节 miRNA192敲除及其功能验证56-70
• 1 材料和方法56-60
• 1.1 材料56
• 1.2 TALEN识别序列设计56-57
• 1.3 TALEN左右臂载体组装连接及鉴定57-58
• 1.4 嘌呤霉素最小致死浓度58
• 1.5 TALEN左右臂质粒载体共转染IPEC-J2细胞58
• 1.6 嘌呤霉素筛选及鉴定58
• 1.7 单克隆细胞株挑选及鉴定58
• 1.8 阳性单克隆细胞miR-192的表达鉴定58-59
• 1.9 miR-192宿主基因及靶基因转录水平检测59-60
• 1.10 大肠杆菌黏附水平验证60
• 2 结果与分析60-68
• 2.1 酶切鉴定结果60
• 2.2 测序比对结果60-63
• 2.3 转染IPEC-J2细胞及靶点区域片段扩增及测序63-64
• 2.4 单克隆细胞株miR-192打靶情况的鉴定及分析64-66
• 2.5 miR-192表达水平的检测66-67
• 2.6 miR-192宿主基因扩增和转录水平67
• 2.7 miR-192靶基因在敲除细胞中表达水平67-68
• 2.8 miR-192敲除对IPEC-J2细胞黏附大肠杆菌能力的影响68
• 3 讨论68-70
• 第三章 梅山断奶仔猪大肠杆菌抗性相关microRNAs筛选及其功能分析70-109
• 第一节 miRNA192在梅山猪中表达分析70-73
• 1 材料与方法70-71
• 1.1 材料70
• 1.2 miR-192探针合成70
• 1.3 总RNA抽提及反转录70-71
• 1.4 组织表达谱分析71
• 2 结果与分析71-72
• 2.1 miR-192的组织表达谱检测71-72
• 2.2 攻毒组与对照组个体十二指肠和空肠中miR-192的表达72
• 3 讨论72-73
• 第二节 梅山猪断奶仔猪大肠杆菌抗性型和敏感型全同胞个体差异microRNAs的筛选73-87
• 1 材料与方法73-76
• 1.1 实验动物及样本采集73
• 1.2 试剂材料73
• 1.3 小RNA文库建立及高通量测序73-74
• 1.4 测序数据的质量控制和预处理分析74
• 1.5 序列比对及分类注释74
• 1.6 比对统计74-75
• 1.7 碱基偏好性统计分析75
• 1.8 Novel miRNAs预测75
• 1.9 miRNA差异表达分析75
• 1.10 差异miRNA功能分析75
• 1.11 靶基因GO功能分析75-76
• 1.12 靶基因KEGG pathway分析76
• 1.13 差异miRNAs的QPCR验证76
• 2 结果与分析76-85
• 2.1 总RNA质量检测76-77
• 2.2 染色体分布77-78
• 2.3 small RNA序列分类统计78-79
• 2.4 碱基偏好性统计79-80
• 2.5 小RNA在抗性敏感型个体中分布80
• 2.6 差异miRNA筛选80-82
• 2.7 差异miRNA靶基因功能富集分析82-84
• 2.8 差异miRNAs定量PCR验证84
• 2.9 关键靶基因分析和确定84-85
• 3 讨论85-87
• 第三节 大肠杆菌侵染对细胞中TLR4通路相关基因的影响87-92
• 1 材料方法87-88
• 2 结果与分析88-90
• 3 讨论90-92
• 第四节 MyD88基因沉默及其对所在TLR4通路基因表达水平的影响92-102
• 1 材料与方法92-95
• 1.1 材料92
• 1.2 引物设计及序列合成92-93
• 1.3 干扰载体构建93
• 1.4 表达载体构建93-94
• 1.5 细胞转染及干扰效率验证94
• 1.6 慢病毒载体包装及滴度测定94-95
• 1.7 病毒液感染猪IPEC-J2和PK15细胞95
• 1.8 定量检测MyD88基因沉默PK15细胞中TLR4通路相关基因表达95
• 1.9 细胞培养上清炎性因子检测95
• 2 结果分析95-100
• 2.1 载体构建95-96
• 2.2 干扰效率验证96-97
• 2.3 慢病毒液滴度测定97
• 2.4 干扰病毒颗粒对IPEC-J2和PK15细胞MyD88的干扰效率97-99
• 2.5 MyD88基因沉默对TLR4通路相关基因表达的影响99
• 2.6 MyD88基因沉默对细胞培养液中免疫因子水平影响99-100
• 3 讨论100-102
• 第五节 大肠杆菌侵袭对MyD88基因沉默PK15细胞的效应分析102-109
• 1 材料与方法102
• 2 结果与分析102-107
• 3 讨论107-109
• 全文结论109-110
• 创新之处110-111
• 参考文献111-121
• 致谢121-123
• 攻读学位期间发表学术论文123-124

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