水稻ABC转运蛋白OsABCG36的耐镉分子机制研究
发布时间：2021-05-16 08:55
镉（Cadmium,Cd）是一种高毒性的重金属元素,对植物的生长发育具有严重的危害作用。自然环境中的Cd含量通常很低,然而,随着工农业生产的快速发展,矿产开采冶炼和含Cd磷肥的使用等人类活动的扩张,均导致了土壤中重金属Cd污染的增加。水稻是人们重要的粮食作物之一,其品质安全对人们的身体健康至关重要。在水稻的生长过程中,Cd可以从Cd污染的土壤中被吸收进入根部和地上部分,严重影响其代谢、品质和安全。因此,减轻土壤中过量的Cd对水稻以及其他作物生长发育的毒害是科技工作者们研究的重要课题。ATP结合盒（ATP-binding cassette,简称ABC）蛋白是一类多样性的跨膜转运蛋白家族,广泛存在于从细菌到人类的各种生物体中。ABC转运蛋白主要通过水解ATP产生能量,完成底物的转运,包括激素、脂类、无机酸、谷胱甘肽复合物、多肽和重金属等。有研究报道,ABC转运蛋白在植物的Cd解毒过程中发挥着重要的作用。ABCG转运蛋白属于ABC转运蛋白家族的G亚家族。目前为止,关于水稻ABCG转运蛋白参与Cd解毒的研究还比较少。本研究主要通过CRISPR/Cas9基因编辑技术来构建水稻G型ABC转运蛋白基...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 重金属污染的现状分析
1.2 重金属对植物的损伤
1.2.1 重金属对植物生长发育的影响
1.2.2 重金属对植物膜透性的损伤
1.2.3 重金属对植物细胞超微结构及光合作用的影响
1.2.4 重金属对植物体内抗性酶活性的损伤
1.3 植物对重金属的排斥机制
1.4 植物对重金属的耐受机制
1.4.1 植物修复
1.4.2 植物螯合素与谷胱甘肽
1.4.3 金属硫蛋白
1.4.4 抗氧化酶的防御机制
1.4.5 激素与重金属的关系
1.5 转运蛋白与重金属的关系
1.5.1 重金属ATPase
1.5.2 阳离子扩散促进子蛋白
1.5.3 锌/铁调节转运蛋白家族
1.5.4 NRAMP家族
1.5.5 铜离子转运蛋白
1.5.6 YSL蛋白家族
1.5.7 ABC转运蛋白家族
1.5.7.1 ABC转运蛋白的结构与分类
1.5.7.2 植物体ABC转运蛋白与重金属的相关研究
1.5.7.3 ABCG亚族
1.6 重金属Cd的毒害
1.6.1 镉的理化性质
1.6.2 植物体内镉的吸收与代谢
1.6.3 ABC转运蛋白与镉的相关研究
1.6.4 镉对水稻的毒害及相关研究
1.7 研究背景及意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 本研究主要使用的仪器设备
2.3 本研究使用的引物序列
2.4 各溶液配制
2.5 本研究中各培养基配制
2.5.1 LB培养基制备
2.5.2 酵母SD-ura培养基制备
2.5.3 酵母SD-metal培养基制备
2.5.4 酵母YPD培养基制备
2.5.5 酵母培养基中氨基酸混合物制备
2.5.6 1/2 MS培养基制备
2.5.7 农杆菌介导的遗传转化中的各培养基配制
2.6 DNA分子操作技术
2.6.1 植物基因组总DNA提取
2.6.2 小量质粒DNA的提取
2.6.3 大量质粒DNA的提取
2.6.4 植物RNA的提取及c DNA的合成
2.6.5 荧光定量PCR的进行
2.6.6 PCR反应
2.6.7 DNA的纯化
2.6.8 琼脂糖凝胶电泳
2.6.9 酶切和连接反应
2.7 化学转化感受态细胞的制备
2.8 大肠杆菌的化学转化及阳性克隆的验证
2.9 OsABCG36 表达水平分析中的样品处理
2.10 抗体免疫染色实验
2.11 水稻原生质体的分离及转化
2.11.1 制备水稻原生质体的各种溶液配制
2.11.2 黄化苗培养
2.11.3 水稻原生质体分离过程
2.11.4 水稻原生质体转化实验
2.12 酵母菌相关实验
2.12.1 酵母感受态细胞制备
2.12.2 酵母细胞的转化实验
2.12.3 OsABCG36 在酵母细胞中的转运活性分析
2.12.4 酵母细胞镉排出实验
2.12.5 OsABCG36 在酵母细胞中的定位分析
2.13 OsABCG36 突变体植株构建的相关实验
2.13.1 pCRISPR-OsABCG36 敲除载体的构建
2.13.2 农杆菌电击感受态细胞的制备
2.13.3 农杆菌感受态细胞的电击转化
2.13.4 农杆菌介导的野生型日本晴水稻的遗传转化
2.14 植株实验
2.14.1 植株相对根长分析
2.14.2 突变体植株短期镉处理表型分析
2.14.3 突变体根中总镉含量分析
2.14.4 突变体根细胞液中镉含量测定
2.14.5 突变体植株长期镉处理元素含量分析
2.14.6 植物木质部液中镉含量分析
2.15 其他相关实验方法
2.15.1 本研究所用抗生素浓度
2.15.2 菌株的活化
2.15.3 菌株的培养与保存
第三章 结果与分析
3.1 OsABCG36 基因生物信息学分析
3.1.1 OsABCG36 基因基本特征
3.1.2 OsABCG36 蛋白的结构域分析
3.1.3 OsABCG36 的同源性分析
3.2 OsABCG36 的表达模式分析
3.2.1 OsABCG36 在不同组织中的表达水平分析
3.2.2 Cd处理后OsABCG36 表达水平分析
3.2.3 水稻中OsABCG36 同源基因表达水平分析
3.3 OsABCG36 的组织定位分析
3.3.1 POsABCG36-GFP融合表达载体的构建及植株转化
3.3.2 抗体免疫染色实验
3.4 OsABCG36 蛋白的亚细胞定位分析
3.4.1 GFP-OsABCG36 融合蛋白表达载体的构建
3.4.2 GFP-OsABCG36 与细胞膜标记蛋白的共定位分析
3.4.3 GFP-OsABCG36 与液泡膜标记蛋白的共定位分析
3.5 OsABCG36 在酵母细胞中的功能分析
3.5.1 OsABCG36 酵母表达载体构建
3.5.2 OsABCG36 在酵母中Cd转运活性分析
3.5.3 OsABCG36 在酵母中Zn转运活性分析
3.5.4 酵母中OsABCG36 的定位分析
3.6 OsABCG36 纯合突变体的构建及鉴定
3.6.1 OsABCG36 纯合突变体植株的构建
3.6.2 OsABCG36 纯合突变体植株的鉴定
3.7 OsABCG36 突变体植株的短期金属处理表型分析
3.7.1 OsABCG36 突变体植株的不同金属耐受性分析
3.7.2 OsABCG36 突变体植株短期镉处理表型
3.8 根中总镉和细胞液中镉含量分析
3.9 长期镉处理元素含量测定分析
3.10 植株木质部汁液中镉含量分析
第四章 讨论
4.1 OsABCG36 参与了镉的外排
4.2 OsABCG36与AtABCG36 的功能比较
4.3 OsABCG36 在水稻解镉毒中的作用机制
第五章 结论与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]安徽省某市农田土壤与农产品重金属污染评价[J]. 岳蛟,叶明亮,杨梦丽,崔俊义,马友华. 农业资源与环境学报. 2019(01)
[2]黔南州不同茶区土壤和茶叶重金属污染区域的差异性[J]. 张清海,林绍霞,谭红,朱平,林昌虎. 贵州农业科学. 2012(09)
[3]土壤重金属污染的植物修复[J]. 屈冉,孟伟,李俊生,丁爱中,金亚波. 生态学杂志. 2008(04)
[4]我国农田污染与农产品质量安全现状、问题及对策[J]. 钟秀明,武雪萍. 中国农业资源与区划. 2007(05)
[5]镉在土壤-植物系统中的迁移转化及其影响因素[J]. 赵中秋,朱永官,蔡运龙. 生态环境. 2005(02)
[6]Hg2+、Cd2+污染对水稻叶肉细胞伤害的超微观察[J]. 王逸群,郑金贵,陈文列,陈莲云. 福建农业大学学报. 2004(04)
[7]土壤Pb Cd污染的植物效应（Ⅰ）——Pb污染对水稻生长和Pb含量的影响[J]. 郑春荣,孙兆海,周东美,刘凤枝,陈怀满. 农业环境科学学报. 2004(03)
[8]铜、砷及其复合污染对黄豆（Glycine max）影响的初步研究[J]. 王友保,刘登义,张莉,郭虎. 应用生态学报. 2001(01)
[9]过量铜对苹果树生长及代谢的影响[J]. 刘春生,史衍玺,马丽,叶优良,杨吉华,张福锁. 植物营养与肥料学报. 2000(04)
[10]镉对蒜根生长的毒害及抗坏血酸、铁盐的解毒效应[J]. 赵博生,莫华. 武汉植物学研究. 1997(02)
本文编号：3189388
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：132 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 前言
1.1 重金属污染的现状分析
1.2 重金属对植物的损伤
1.2.1 重金属对植物生长发育的影响
1.2.2 重金属对植物膜透性的损伤
1.2.3 重金属对植物细胞超微结构及光合作用的影响
1.2.4 重金属对植物体内抗性酶活性的损伤
1.3 植物对重金属的排斥机制
1.4 植物对重金属的耐受机制
1.4.1 植物修复
1.4.2 植物螯合素与谷胱甘肽
1.4.3 金属硫蛋白
1.4.4 抗氧化酶的防御机制
1.4.5 激素与重金属的关系
1.5 转运蛋白与重金属的关系
1.5.1 重金属ATPase
1.5.2 阳离子扩散促进子蛋白
1.5.3 锌/铁调节转运蛋白家族
1.5.4 NRAMP家族
1.5.5 铜离子转运蛋白
1.5.6 YSL蛋白家族
1.5.7 ABC转运蛋白家族
1.5.7.1 ABC转运蛋白的结构与分类
1.5.7.2 植物体ABC转运蛋白与重金属的相关研究
1.5.7.3 ABCG亚族
1.6 重金属Cd的毒害
1.6.1 镉的理化性质
1.6.2 植物体内镉的吸收与代谢
1.6.3 ABC转运蛋白与镉的相关研究
1.6.4 镉对水稻的毒害及相关研究
1.7 研究背景及意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.2 本研究主要使用的仪器设备
2.3 本研究使用的引物序列
2.4 各溶液配制
2.5 本研究中各培养基配制
2.5.1 LB培养基制备
2.5.2 酵母SD-ura培养基制备
2.5.3 酵母SD-metal培养基制备
2.5.4 酵母YPD培养基制备
2.5.5 酵母培养基中氨基酸混合物制备
2.5.6 1/2 MS培养基制备
2.5.7 农杆菌介导的遗传转化中的各培养基配制
2.6 DNA分子操作技术
2.6.1 植物基因组总DNA提取
2.6.2 小量质粒DNA的提取
2.6.3 大量质粒DNA的提取
2.6.4 植物RNA的提取及c DNA的合成
2.6.5 荧光定量PCR的进行
2.6.6 PCR反应
2.6.7 DNA的纯化
2.6.8 琼脂糖凝胶电泳
2.6.9 酶切和连接反应
2.7 化学转化感受态细胞的制备
2.8 大肠杆菌的化学转化及阳性克隆的验证
2.9 OsABCG36 表达水平分析中的样品处理
2.10 抗体免疫染色实验
2.11 水稻原生质体的分离及转化
2.11.1 制备水稻原生质体的各种溶液配制
2.11.2 黄化苗培养
2.11.3 水稻原生质体分离过程
2.11.4 水稻原生质体转化实验
2.12 酵母菌相关实验
2.12.1 酵母感受态细胞制备
2.12.2 酵母细胞的转化实验
2.12.3 OsABCG36 在酵母细胞中的转运活性分析
2.12.4 酵母细胞镉排出实验
2.12.5 OsABCG36 在酵母细胞中的定位分析
2.13 OsABCG36 突变体植株构建的相关实验
2.13.1 pCRISPR-OsABCG36 敲除载体的构建
2.13.2 农杆菌电击感受态细胞的制备
2.13.3 农杆菌感受态细胞的电击转化
2.13.4 农杆菌介导的野生型日本晴水稻的遗传转化
2.14 植株实验
2.14.1 植株相对根长分析
2.14.2 突变体植株短期镉处理表型分析
2.14.3 突变体根中总镉含量分析
2.14.4 突变体根细胞液中镉含量测定
2.14.5 突变体植株长期镉处理元素含量分析
2.14.6 植物木质部液中镉含量分析
2.15 其他相关实验方法
2.15.1 本研究所用抗生素浓度
2.15.2 菌株的活化
2.15.3 菌株的培养与保存
第三章 结果与分析
3.1 OsABCG36 基因生物信息学分析
3.1.1 OsABCG36 基因基本特征
3.1.2 OsABCG36 蛋白的结构域分析
3.1.3 OsABCG36 的同源性分析
3.2 OsABCG36 的表达模式分析
3.2.1 OsABCG36 在不同组织中的表达水平分析
3.2.2 Cd处理后OsABCG36 表达水平分析
3.2.3 水稻中OsABCG36 同源基因表达水平分析
3.3 OsABCG36 的组织定位分析
3.3.1 POsABCG36-GFP融合表达载体的构建及植株转化
3.3.2 抗体免疫染色实验
3.4 OsABCG36 蛋白的亚细胞定位分析
3.4.1 GFP-OsABCG36 融合蛋白表达载体的构建
3.4.2 GFP-OsABCG36 与细胞膜标记蛋白的共定位分析
3.4.3 GFP-OsABCG36 与液泡膜标记蛋白的共定位分析
3.5 OsABCG36 在酵母细胞中的功能分析
3.5.1 OsABCG36 酵母表达载体构建
3.5.2 OsABCG36 在酵母中Cd转运活性分析
3.5.3 OsABCG36 在酵母中Zn转运活性分析
3.5.4 酵母中OsABCG36 的定位分析
3.6 OsABCG36 纯合突变体的构建及鉴定
3.6.1 OsABCG36 纯合突变体植株的构建
3.6.2 OsABCG36 纯合突变体植株的鉴定
3.7 OsABCG36 突变体植株的短期金属处理表型分析
3.7.1 OsABCG36 突变体植株的不同金属耐受性分析
3.7.2 OsABCG36 突变体植株短期镉处理表型
3.8 根中总镉和细胞液中镉含量分析
3.9 长期镉处理元素含量测定分析
3.10 植株木质部汁液中镉含量分析
第四章 讨论
4.1 OsABCG36 参与了镉的外排
4.2 OsABCG36与AtABCG36 的功能比较
4.3 OsABCG36 在水稻解镉毒中的作用机制
第五章 结论与展望
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文目录
【参考文献】：
期刊论文
[1]安徽省某市农田土壤与农产品重金属污染评价[J]. 岳蛟,叶明亮,杨梦丽,崔俊义,马友华. 农业资源与环境学报. 2019(01)
[2]黔南州不同茶区土壤和茶叶重金属污染区域的差异性[J]. 张清海,林绍霞,谭红,朱平,林昌虎. 贵州农业科学. 2012(09)
[3]土壤重金属污染的植物修复[J]. 屈冉,孟伟,李俊生,丁爱中,金亚波. 生态学杂志. 2008(04)
[4]我国农田污染与农产品质量安全现状、问题及对策[J]. 钟秀明,武雪萍. 中国农业资源与区划. 2007(05)
[5]镉在土壤-植物系统中的迁移转化及其影响因素[J]. 赵中秋,朱永官,蔡运龙. 生态环境. 2005(02)
[6]Hg2+、Cd2+污染对水稻叶肉细胞伤害的超微观察[J]. 王逸群,郑金贵,陈文列,陈莲云. 福建农业大学学报. 2004(04)
[7]土壤Pb Cd污染的植物效应（Ⅰ）——Pb污染对水稻生长和Pb含量的影响[J]. 郑春荣,孙兆海,周东美,刘凤枝,陈怀满. 农业环境科学学报. 2004(03)
[8]铜、砷及其复合污染对黄豆（Glycine max）影响的初步研究[J]. 王友保,刘登义,张莉,郭虎. 应用生态学报. 2001(01)
[9]过量铜对苹果树生长及代谢的影响[J]. 刘春生,史衍玺,马丽,叶优良,杨吉华,张福锁. 植物营养与肥料学报. 2000(04)
[10]镉对蒜根生长的毒害及抗坏血酸、铁盐的解毒效应[J]. 赵博生,莫华. 武汉植物学研究. 1997(02)
本文编号：3189388
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