应用CRISPR/Cas9基因编辑技术制备MC1R基因敲除兔的研究
发布时间：2021-05-17 04:39
毛色是家畜重要的质量性状之一,与MC1R基因调控黑色素的合成相关。家兔作为毛用、皮用和实验动物,其毛皮颜色与其经济价值密切相关。为此,本研究应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对敲除家兔MC1R基因获得新毛色家兔的可行性进行了探讨,研究主要取得如下结果:1、兔MC1R基因编码区的克隆与分析本研究对莲山黑兔、福建黄兔、新西兰大白兔、巨灰兔和巨型格仔兔的MC1R基因完整CDS区进行了PCR扩增,测序结果显示扩增片段与Gen Bank上发布的兔MC1R的CDS序列一致。随后对上述CDS序列进行了生物信息学分析:不同毛色兔MC1R基因的多重序列比对结果显示巨灰兔没有缺失突变,等位基因属于野生型E;莲山黑兔、新西兰大白兔和巨型格仔兔存在c.281＿286del缺失,等位基因属于黑色显性上位型ED;福建黄兔存在c.304＿333del缺失,等位基因属于隐性黄/红色型e。2、CRSIPR/Cas9介导的MC1R基因敲除效率检测本研究根据莲山黑兔MC1R基因CDS区的测序结果和蛋白质结构预测,在第二和第五个跨膜结构域上设计了两条sg RNA靶序列,成功构建了CRISPR/Ca...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：157 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一部分 文献综述
第一章 哺乳动物毛色形成机制
1.1 黑色素形成过程
1.2 影响黑色素生成的分子途径
1.3 毛干中的黑色素生成
1.4 角质形成细胞与黑色素的转运
1.5 黑色素生成中的分子调控
1.5.1 α-MSH的调控
1.5.2 MITF的调控
1.5.3 Wnt信号通路的调控
1.5.4 PKC家族的调控
1.5.5 EDN信号通路的调控
1.5.6 SOX家族的调控
1.5.7 PAX3的调控
1.6 黑色素调控基因的变异与动物毛色决定
1.6.1 MC1R和 ASIP基因
1.6.2 KIT基因
1.6.3 TYRP1基因
1.6.4 MITF基因
1.6.5 EDNRB基因
1.7 小结与展望
第二章 MC1R基因的研究进展
2.1 MC1R的结构
2.2 MC1R活性调节
2.3 MC1R下游信号通路与第二信使CAMP
2.3.1 MC1R与色素沉积
2.3.2 MC1R的紫外线保护作用
2.4 MC1R的激素信号调节
2.5 MC1R基因的多态性与动物毛色形成
2.5.1 牛
2.5.2 猪
2.5.3 犬科动物
2.5.4 马
2.5.5 羊
2.5.6 兔
2.6 小结与展望
第三章 CRISPR基因编辑系统的研究进展
3.1 基因编辑系统的发展历程
3.1.1 第一代基因编辑系统:ZFN
3.1.2 第二代基因编辑系统:TALEN
3.1.3 第三代基因编辑系统:CRISPR
3.2 CRISPR基因编辑系统在生命科学基础研究中的应用
3.2.1 基因敲除
3.2.2 基因敲入
3.2.3 单碱基基因编辑
3.2.4 染色体缺失、重排和核型工程
3.2.5 基因驱动
3.2.6 抑制靶基因表达
3.2.7 激活靶基因表达
3.2.8 染色质结构成像、RNA转录和蛋白质定位跟踪
3.2.9 RNA的基因编辑
3.2.10 质粒的克隆和诱变
3.3 CRISPR基因编辑系统在畜牧业中的应用
3.3.1 提高家畜经济性状
3.3.2 提高家畜繁殖力和抗病性
3.3.3 提高畜产品质量
3.3.4 提高动物福利
3.4 CRISPR/CAS9 基因编辑系统在家兔中的应用
3.5 本研究的目的与意义
第二部分 试验研究
第四章 兔MC1R基因编码区的克隆与分析
前言
4.1 试验材料及仪器设备
4.1.1 组织材料、菌株和载体
4.1.2 试验试剂
4.1.3 仪器设备
4.1.4 主要培养基和溶液的配制
4.2 试验方法
4.2.1 基因组DNA的提取
4.2.2 引物的设计与合成
4.2.3 目的基因编码序列的扩增
4.2.4 目的产物的回收与纯化
4.2.5 目的片段的连接与转化
4.2.6 质粒的提取
4.2.7 双酶切鉴定阳性重组质粒
4.2.8 数据统计与分析
4.3 试验结果
4.3.1 不同毛色兔MC1R基因CDS区 PCR扩增结果
4.3.2 不同毛色兔MC1R基因编码区序列测定结果
4.3.3 兔MC1R基因的生物信息学分析
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 CRSIPR/CAS9 介导的MC1R基因敲除效率检测
前言
5.1 试验材料及仪器设备
5.1.1 试验材料、菌株和载体
5.1.2 试验试剂
5.1.3 仪器设备
5.1.4 主要培养基和溶液的配制
5.2 试验方法
5.2.1 MC1R基因靶序列的设计与合成
5.2.2 CRISPR/Cas9 系统相关载体的构建
5.2.3 质粒的转化及鉴定
5.2.4 去内毒提取质粒
5.2.5 细胞的复苏与培养
5.2.6 Cas9 载体、sg RNA载体和RGS报告载体共转293T细胞
5.2.7 Cas9 载体和sg RNA载体共转兔胎儿成纤维(RFF)细胞
5.2.8 细胞基因组的提取
5.2.9 体外转录模板的制备
5.2.10 sgRNA的体外转录
5.2.11 Cas9 m RNA的体外转录
5.2.12 母兔的超排处理与胚胎收集
5.2.13 受精卵的胞质注射
5.2.14 PCR扩增单个胚胎目的序列检测突变效率
5.2.15 T7E1酶切检测突变效率
5.2.16 数据统计分析
5.3 试验结果
5.3.1 兔MC1R基因sg RNA的设计及CRISPR/Cas9 相关表达载体的构建
5.3.2 CRISPR/Cas9 系统在293T细胞上的活性验证
5.3.3 CRISPR/Cas9 系统在兔胎儿成纤维细胞上的活性验证
5.3.4 CRISPR/Cas9 系统在兔胚胎水平敲除效率的验证
5.4 讨论
5.5 结论
第六章 MC1R敲除兔的生产与新毛色形成机制的初探
前言
6.1 试验材料及仪器设备
6.1.1 组织材料、菌株和载体
6.1.2 试验试剂
6.1.3 仪器设备
6.1.4 主要溶液的配制
6.2 试验方法
6.2.1 体外转录制备Cas9 m RNA及 sg RNA
6.2.2 母兔的超排处理与胚胎收集
6.2.3 受精卵的胞质注射
6.2.4 胚胎移植与妊娠
6.2.5 F0代仔兔基因型的检测
6.2.6 阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测
6.2.7 阳性兔的脱靶检测
6.2.8 PCR产物的纯化
6.2.9 皮肤组织石蜡切片制作及H&E染色观察
6.2.10 皮肤组织RNA的提取
6.2.11 RNA反转录合成c DNA
6.2.12 实时荧光定量PCR检测相关基因表达量
6.2.13 数据统计
6.3 试验结果
6.3.1 CRISPR/Cas9 介导的MC1R基因敲除兔的生产
6.3.2 MC1R敲除兔的基因型及表型鉴定
6.3.3 阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测
6.3.4 脱靶效应检测
6.3.5 MC1R敲除兔新毛色形成机制的初探
6.4 讨论
6.5 结论
全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]马毛色遗传机理研究进展[J]. 赵若阳,赵一萍,李蓓,格日乐其木格,张心壮,陶克涛,图格琴,旭仁其木格,青柏,李超,白东义,芒来. 遗传. 2018(05)
[2]6品系彩色獭兔Mc1r和agouti基因mRNA表达量与毛色相关性[J]. 杨翠军,葛剑,陈赛娟,刘亚娟,陈宝江,谷子林. 中国兽医学报. 2016(08)
[3]水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究[J]. 林宇纾,蒋恒洁,杨丰硕,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2015(10)
[4]不同毛色贵州水牛MC1R、TYR基因SNP研究[J]. 敖啟燕,胡玲玲,罗师红,赵永超,王振,刘若余. 中国牛业科学. 2015(04)
[5]哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究[J]. 李洪涛,曾献存,张文祥,赵海璇,惠文巧,刘钢,罗燕,班谦,赵宗胜,贾斌. 畜牧兽医学报. 2013(03)
[6]人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J]. 肖安,胡莹莹,王唯晔,杨志芃,王展翔,黄鹏,佟向军,张博,林硕. 遗传. 2011(07)
[7]马毛色遗传的分子基础与应用[J]. 李蓓,何小龙,赵一萍,王晓静,芒来,张焱如. 遗传. 2010(11)
博士论文
[1]应用CRISPR/Cas9系统对哺乳动物GDF8基因编辑的初步研究[D]. 粟小平.广西大学 2018
硕士论文
[1]TYR、ASIP基因多态性与绵羊毛色相关的研究[D]. 孟浩浩.石河子大学 2014
[2]10个中国地方绵羊品种MC1R和ASIP基因多态性及其与毛色关联性分析[D]. 付冬丽.甘肃农业大学 2013
本文编号：3191093
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：157 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
英文缩略词表
第一部分 文献综述
第一章 哺乳动物毛色形成机制
1.1 黑色素形成过程
1.2 影响黑色素生成的分子途径
1.3 毛干中的黑色素生成
1.4 角质形成细胞与黑色素的转运
1.5 黑色素生成中的分子调控
1.5.1 α-MSH的调控
1.5.2 MITF的调控
1.5.3 Wnt信号通路的调控
1.5.4 PKC家族的调控
1.5.5 EDN信号通路的调控
1.5.6 SOX家族的调控
1.5.7 PAX3的调控
1.6 黑色素调控基因的变异与动物毛色决定
1.6.1 MC1R和 ASIP基因
1.6.2 KIT基因
1.6.3 TYRP1基因
1.6.4 MITF基因
1.6.5 EDNRB基因
1.7 小结与展望
第二章 MC1R基因的研究进展
2.1 MC1R的结构
2.2 MC1R活性调节
2.3 MC1R下游信号通路与第二信使CAMP
2.3.1 MC1R与色素沉积
2.3.2 MC1R的紫外线保护作用
2.4 MC1R的激素信号调节
2.5 MC1R基因的多态性与动物毛色形成
2.5.1 牛
2.5.2 猪
2.5.3 犬科动物
2.5.4 马
2.5.5 羊
2.5.6 兔
2.6 小结与展望
第三章 CRISPR基因编辑系统的研究进展
3.1 基因编辑系统的发展历程
3.1.1 第一代基因编辑系统:ZFN
3.1.2 第二代基因编辑系统:TALEN
3.1.3 第三代基因编辑系统:CRISPR
3.2 CRISPR基因编辑系统在生命科学基础研究中的应用
3.2.1 基因敲除
3.2.2 基因敲入
3.2.3 单碱基基因编辑
3.2.4 染色体缺失、重排和核型工程
3.2.5 基因驱动
3.2.6 抑制靶基因表达
3.2.7 激活靶基因表达
3.2.8 染色质结构成像、RNA转录和蛋白质定位跟踪
3.2.9 RNA的基因编辑
3.2.10 质粒的克隆和诱变
3.3 CRISPR基因编辑系统在畜牧业中的应用
3.3.1 提高家畜经济性状
3.3.2 提高家畜繁殖力和抗病性
3.3.3 提高畜产品质量
3.3.4 提高动物福利
3.4 CRISPR/CAS9 基因编辑系统在家兔中的应用
3.5 本研究的目的与意义
第二部分 试验研究
第四章 兔MC1R基因编码区的克隆与分析
前言
4.1 试验材料及仪器设备
4.1.1 组织材料、菌株和载体
4.1.2 试验试剂
4.1.3 仪器设备
4.1.4 主要培养基和溶液的配制
4.2 试验方法
4.2.1 基因组DNA的提取
4.2.2 引物的设计与合成
4.2.3 目的基因编码序列的扩增
4.2.4 目的产物的回收与纯化
4.2.5 目的片段的连接与转化
4.2.6 质粒的提取
4.2.7 双酶切鉴定阳性重组质粒
4.2.8 数据统计与分析
4.3 试验结果
4.3.1 不同毛色兔MC1R基因CDS区 PCR扩增结果
4.3.2 不同毛色兔MC1R基因编码区序列测定结果
4.3.3 兔MC1R基因的生物信息学分析
4.4 讨论
4.5 结论
第五章 CRSIPR/CAS9 介导的MC1R基因敲除效率检测
前言
5.1 试验材料及仪器设备
5.1.1 试验材料、菌株和载体
5.1.2 试验试剂
5.1.3 仪器设备
5.1.4 主要培养基和溶液的配制
5.2 试验方法
5.2.1 MC1R基因靶序列的设计与合成
5.2.2 CRISPR/Cas9 系统相关载体的构建
5.2.3 质粒的转化及鉴定
5.2.4 去内毒提取质粒
5.2.5 细胞的复苏与培养
5.2.6 Cas9 载体、sg RNA载体和RGS报告载体共转293T细胞
5.2.7 Cas9 载体和sg RNA载体共转兔胎儿成纤维(RFF)细胞
5.2.8 细胞基因组的提取
5.2.9 体外转录模板的制备
5.2.10 sgRNA的体外转录
5.2.11 Cas9 m RNA的体外转录
5.2.12 母兔的超排处理与胚胎收集
5.2.13 受精卵的胞质注射
5.2.14 PCR扩增单个胚胎目的序列检测突变效率
5.2.15 T7E1酶切检测突变效率
5.2.16 数据统计分析
5.3 试验结果
5.3.1 兔MC1R基因sg RNA的设计及CRISPR/Cas9 相关表达载体的构建
5.3.2 CRISPR/Cas9 系统在293T细胞上的活性验证
5.3.3 CRISPR/Cas9 系统在兔胎儿成纤维细胞上的活性验证
5.3.4 CRISPR/Cas9 系统在兔胚胎水平敲除效率的验证
5.4 讨论
5.5 结论
第六章 MC1R敲除兔的生产与新毛色形成机制的初探
前言
6.1 试验材料及仪器设备
6.1.1 组织材料、菌株和载体
6.1.2 试验试剂
6.1.3 仪器设备
6.1.4 主要溶液的配制
6.2 试验方法
6.2.1 体外转录制备Cas9 m RNA及 sg RNA
6.2.2 母兔的超排处理与胚胎收集
6.2.3 受精卵的胞质注射
6.2.4 胚胎移植与妊娠
6.2.5 F0代仔兔基因型的检测
6.2.6 阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测
6.2.7 阳性兔的脱靶检测
6.2.8 PCR产物的纯化
6.2.9 皮肤组织石蜡切片制作及H&E染色观察
6.2.10 皮肤组织RNA的提取
6.2.11 RNA反转录合成c DNA
6.2.12 实时荧光定量PCR检测相关基因表达量
6.2.13 数据统计
6.3 试验结果
6.3.1 CRISPR/Cas9 介导的MC1R基因敲除兔的生产
6.3.2 MC1R敲除兔的基因型及表型鉴定
6.3.3 阳性敲除兔MC1R蛋白结构预测
6.3.4 脱靶效应检测
6.3.5 MC1R敲除兔新毛色形成机制的初探
6.4 讨论
6.5 结论
全文结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]马毛色遗传机理研究进展[J]. 赵若阳,赵一萍,李蓓,格日乐其木格,张心壮,陶克涛,图格琴,旭仁其木格,青柏,李超,白东义,芒来. 遗传. 2018(05)
[2]6品系彩色獭兔Mc1r和agouti基因mRNA表达量与毛色相关性[J]. 杨翠军,葛剑,陈赛娟,刘亚娟,陈宝江,谷子林. 中国兽医学报. 2016(08)
[3]水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究[J]. 林宇纾,蒋恒洁,杨丰硕,崔奎青,石德顺,刘庆友. 中国畜牧兽医. 2015(10)
[4]不同毛色贵州水牛MC1R、TYR基因SNP研究[J]. 敖啟燕,胡玲玲,罗师红,赵永超,王振,刘若余. 中国牛业科学. 2015(04)
[5]哈萨克绵羊MC1R和ASIP基因多态性及表达量与被毛颜色表型相关性的研究[J]. 李洪涛,曾献存,张文祥,赵海璇,惠文巧,刘钢,罗燕,班谦,赵宗胜,贾斌. 畜牧兽医学报. 2013(03)
[6]人工锌指核酸酶介导的基因组定点修饰技术[J]. 肖安,胡莹莹,王唯晔,杨志芃,王展翔,黄鹏,佟向军,张博,林硕. 遗传. 2011(07)
[7]马毛色遗传的分子基础与应用[J]. 李蓓,何小龙,赵一萍,王晓静,芒来,张焱如. 遗传. 2010(11)
博士论文
[1]应用CRISPR/Cas9系统对哺乳动物GDF8基因编辑的初步研究[D]. 粟小平.广西大学 2018
硕士论文
[1]TYR、ASIP基因多态性与绵羊毛色相关的研究[D]. 孟浩浩.石河子大学 2014
[2]10个中国地方绵羊品种MC1R和ASIP基因多态性及其与毛色关联性分析[D]. 付冬丽.甘肃农业大学 2013
本文编号：3191093
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