代谢型谷氨酸受体2型作为狂犬病病毒入侵宿主细胞受体的研究
发布时间：2021-05-17 05:00
狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起的一种人兽共患病,以感染中枢神经系统（Central nervous system,CNS）并造成严重神经症状为主要特征,一旦发病致死率高达100%。全世界每年大约60,000人死于该病,其中受影响最为严重的是印度和中国。针对该病通过疫苗接种预防为主,目前尚无有效的治疗药物。RABV的已知受体包括乙酰胆碱受体、神经细胞粘附分子以及低亲和力的神经营养因子受体等,但是研究表明它们都不能在体内对病毒感染起决定性作用。对于一种多受体病毒,还存在有其他未知的宿主因子在RABV侵染过程中发挥受体功能。本团队前期研究工作利用人类全基因组RNA干扰文库从HEK-293细胞中筛选出代谢型谷氨酸受体2型（Metabotropic glutamate receptors type 2,mGluR2）。mGluR2属于C类G蛋白偶联受体家族（GPCRs）中的II型代谢型谷氨酸受体,在中枢神经系统中表达水平相对较高,其表达或功能异常将导致一系列的神经退行性疾病。但是目前尚无研究发现mGluR2在RABV入侵宿主细胞过程中发挥的作用。因此本研究目的首先...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 狂犬病的流行病学
1.2 狂犬病的临床症状
1.3 RABV致病机理
1.3.1 RABV感染CNS造成的结构损伤及其机制
1.3.2 RABV造成神经功能紊乱的机制
1.4 RABV分子病原学
1.5 RABV的入侵过程
1.6 RABV受体研究进展
1.6.1 尼古丁乙酰胆碱受体
1.6.2 神经细胞粘连分子受体
1.6.3 低亲和力的神经生长因子受体
1.6.4 其它可能受体
1.7 代谢型谷氨酸受体研究进展
1.7.1 mGluRs分类
1.7.2 mGluRs的结构
1.7.3 mGluR2的生理功能及其相关的神经性疾病
1.7.4 mGluRs激活的下游信号以及内吞过程的研究进展
1.8 本研究目的意义
第二章 mGluR2在RABV入侵宿主细胞过程中发挥作用的鉴定
2.1 材料和方法
2.1.1 细胞
2.1.2 载体质粒和病毒
2.1.3 抗体、可溶性蛋白和siRNA
2.1.4 其它试剂耗材
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 试剂配制
2.1.7 不同物种mGluR2同源性分析
2.1.8 病毒的制备和滴定
2.1.9 RNA干扰试验
2.1.10 siRNA细胞毒性检测试验
2.1.11 Trizol法提取细胞总RNA
2.1.12 荧光定量PCR（qRT-PCR）
2.1.13 间接免疫荧光检测mGluR2-mCherry的表达
2.1.14 Western Blotting (WB)检测
2.1.15 WB检测mGluR2-mCherry的表达
2.1.16 激光共聚焦试验检测mGluR2-mCherry膜表面表达情况
2.1.17 细胞膜蛋白的提取及鉴定
2.1.18 过表达mGluR2后病毒生长曲线测定
2.2 结果
2.2.1 不同物种mGluR2相似性分析
2.2.2 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在HEK-293 细胞中的复制
2.2.3 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在N2a细胞中的复制
2.2.4 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在SK-N-SH细胞中的复制
2.2.5 沉默mGluR2抑制了VSV-eGFP在HEK-293 细胞中的复制
2.2.6 过表达mGluR2-mCherry的验证
2.2.7 利用WB分析细胞膜表面mGluR2表达情况
2.2.8 过表达mGluR2-mCherry促进ERA-eGFP感染HEK-293 细胞
2.3 讨论
第三章 mGluR2作为RABV入侵宿主细胞受体的鉴定
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒和病毒
3.1.2 抗体和试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 仪器设备
3.1.5 检测细胞沉淀中的蛋白互作
3.1.6 pGEX-4T-mGluR2和p ET-28a-ERAG重组表达载体的构建
3.1.7 mGluR2-GST与ERAG-His的可溶性表达
3.1.8 可溶性重组蛋白的纯化
3.1.9 纯化蛋白的浓度的检测
3.1.10 验证蛋白间存在直接相互作用
3.1.11 小鼠大脑皮层原代神经元细胞的制备培养
3.1.12 抗体阻断病毒感染试验
3.1.13 抗体竞争性Pulldown试验
3.1.14 可溶性蛋白体外中和病毒感染试验
3.1.15 mGluR2-GST中和病毒感染小鼠试验
3.2 结果
3.2.1 ERAG与mGluR2之间存在相互作用
3.2.2 RABV强毒株和街毒株囊膜糖与mGluR2之间存在相互作用
3.2.3 mGluR2与RABV G蛋白的相互作用具有种属特异性
3.2.4 mGluR2-GST和ERAG-His诱导表达和SDS-PAGE分析
3.2.5 mGluR2-GST和ERAG-His可溶性蛋白的纯化
3.2.6 RABVG蛋白与mGluR2存在直接的相互作用
3.2.7 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP感染HEK-293 细胞
3.2.8 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP感染神经细胞
3.2.9 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP体外感染的机制
3.2.10 mGluR2可溶性蛋白封闭ERA体外感染
3.2.11 mGluR2可溶性蛋白封闭GX09街毒株体内感染试验
3.3 讨论
第四章 RABV利用mGluR2进行内吞的机制研究
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒
4.1.2 抗体试剂
4.1.3 仪器设备
4.1.4 检测RABV感染对于细胞表面mGluR2表达水平的影响
4.1.5 检测RABV与mGluR2在HEK293中共定位
4.1.6 酸性条件下mGluR2与ERA G蛋白之间的互作
4.1.7 检测沉默 β-arrestins2基因表达对RABV感染HEK-293 的影响
4.1.8 体外感染RABV后检测胞内c AMP的变化
4.1.9 mGluR2激活剂和抑制剂对于RABV体外感染的影响
4.2 结果
4.2.1 RABV感染促进了mGluR2的内吞
4.2.2 RABV与mGluR2在早期和晚期内吞体中发生共定位
4.2.3 沉默 β-arrestins2基因表达促进RABV感染HEK-293
4.2.4 感染RABV对于胞内c AMP浓度的影响
4.2.5 mGluR2激活剂和抑制剂对于RABV体外感染的影响
4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3191126
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：89 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 狂犬病的流行病学
1.2 狂犬病的临床症状
1.3 RABV致病机理
1.3.1 RABV感染CNS造成的结构损伤及其机制
1.3.2 RABV造成神经功能紊乱的机制
1.4 RABV分子病原学
1.5 RABV的入侵过程
1.6 RABV受体研究进展
1.6.1 尼古丁乙酰胆碱受体
1.6.2 神经细胞粘连分子受体
1.6.3 低亲和力的神经生长因子受体
1.6.4 其它可能受体
1.7 代谢型谷氨酸受体研究进展
1.7.1 mGluRs分类
1.7.2 mGluRs的结构
1.7.3 mGluR2的生理功能及其相关的神经性疾病
1.7.4 mGluRs激活的下游信号以及内吞过程的研究进展
1.8 本研究目的意义
第二章 mGluR2在RABV入侵宿主细胞过程中发挥作用的鉴定
2.1 材料和方法
2.1.1 细胞
2.1.2 载体质粒和病毒
2.1.3 抗体、可溶性蛋白和siRNA
2.1.4 其它试剂耗材
2.1.5 主要仪器设备
2.1.6 试剂配制
2.1.7 不同物种mGluR2同源性分析
2.1.8 病毒的制备和滴定
2.1.9 RNA干扰试验
2.1.10 siRNA细胞毒性检测试验
2.1.11 Trizol法提取细胞总RNA
2.1.12 荧光定量PCR（qRT-PCR）
2.1.13 间接免疫荧光检测mGluR2-mCherry的表达
2.1.14 Western Blotting (WB)检测
2.1.15 WB检测mGluR2-mCherry的表达
2.1.16 激光共聚焦试验检测mGluR2-mCherry膜表面表达情况
2.1.17 细胞膜蛋白的提取及鉴定
2.1.18 过表达mGluR2后病毒生长曲线测定
2.2 结果
2.2.1 不同物种mGluR2相似性分析
2.2.2 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在HEK-293 细胞中的复制
2.2.3 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在N2a细胞中的复制
2.2.4 沉默mGluR2抑制了ERA-eGFP在SK-N-SH细胞中的复制
2.2.5 沉默mGluR2抑制了VSV-eGFP在HEK-293 细胞中的复制
2.2.6 过表达mGluR2-mCherry的验证
2.2.7 利用WB分析细胞膜表面mGluR2表达情况
2.2.8 过表达mGluR2-mCherry促进ERA-eGFP感染HEK-293 细胞
2.3 讨论
第三章 mGluR2作为RABV入侵宿主细胞受体的鉴定
3.1 材料和方法
3.1.1 质粒和病毒
3.1.2 抗体和试剂
3.1.3 实验动物
3.1.4 仪器设备
3.1.5 检测细胞沉淀中的蛋白互作
3.1.6 pGEX-4T-mGluR2和p ET-28a-ERAG重组表达载体的构建
3.1.7 mGluR2-GST与ERAG-His的可溶性表达
3.1.8 可溶性重组蛋白的纯化
3.1.9 纯化蛋白的浓度的检测
3.1.10 验证蛋白间存在直接相互作用
3.1.11 小鼠大脑皮层原代神经元细胞的制备培养
3.1.12 抗体阻断病毒感染试验
3.1.13 抗体竞争性Pulldown试验
3.1.14 可溶性蛋白体外中和病毒感染试验
3.1.15 mGluR2-GST中和病毒感染小鼠试验
3.2 结果
3.2.1 ERAG与mGluR2之间存在相互作用
3.2.2 RABV强毒株和街毒株囊膜糖与mGluR2之间存在相互作用
3.2.3 mGluR2与RABV G蛋白的相互作用具有种属特异性
3.2.4 mGluR2-GST和ERAG-His诱导表达和SDS-PAGE分析
3.2.5 mGluR2-GST和ERAG-His可溶性蛋白的纯化
3.2.6 RABVG蛋白与mGluR2存在直接的相互作用
3.2.7 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP感染HEK-293 细胞
3.2.8 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP感染神经细胞
3.2.9 针对mGluR2抗体阻断ERA-eGFP体外感染的机制
3.2.10 mGluR2可溶性蛋白封闭ERA体外感染
3.2.11 mGluR2可溶性蛋白封闭GX09街毒株体内感染试验
3.3 讨论
第四章 RABV利用mGluR2进行内吞的机制研究
4.1 材料和方法
4.1.1 病毒
4.1.2 抗体试剂
4.1.3 仪器设备
4.1.4 检测RABV感染对于细胞表面mGluR2表达水平的影响
4.1.5 检测RABV与mGluR2在HEK293中共定位
4.1.6 酸性条件下mGluR2与ERA G蛋白之间的互作
4.1.7 检测沉默 β-arrestins2基因表达对RABV感染HEK-293 的影响
4.1.8 体外感染RABV后检测胞内c AMP的变化
4.1.9 mGluR2激活剂和抑制剂对于RABV体外感染的影响
4.2 结果
4.2.1 RABV感染促进了mGluR2的内吞
4.2.2 RABV与mGluR2在早期和晚期内吞体中发生共定位
4.2.3 沉默 β-arrestins2基因表达促进RABV感染HEK-293
4.2.4 感染RABV对于胞内c AMP浓度的影响
4.2.5 mGluR2激活剂和抑制剂对于RABV体外感染的影响
4.3 讨论
第五章 全文结论
参考文献
致谢
个人简历
本文编号：3191126
本文链接：https://www.wllwen.com/shoufeilunwen/nykjbs/3191126.html
