基于生物信息学与多肽组学的花椒籽抗菌肽筛选及抑菌机理研究
发布时间：2021-05-18 12:07
花椒籽（学名椒目）是花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）生产中的主要副产物,其中富含油脂、蛋白质、黑色素、膳食纤维等成分,但长期以来并未得到充分利用。本论文首先利用生物信息学工具和多肽组学技术对花椒籽蛋白酶解液中的抗菌肽进行快速筛选和鉴定,并通过抑菌实验进行活性验证;继而研究所获得抗菌肽的理化性质;最后探讨所得抗菌肽对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理。研究结果将为新型天然抗菌肽的快速筛选鉴定提供新的思路,同时为花椒籽抗菌肽及花椒籽资源的综合开发应用提供重要的理论和技术支撑。取得的主要研究结果如下:1、利用nanoLC-ESI-MS/MS技术和3个生物信息学软件CAMPR3、APD3和AntiBP2对花椒籽蛋白胃蛋白酶解液中的全部肽段进行鉴定和预测,得到16条疑似抗菌肽序列,以大肠杆菌（ATCC 25922）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）、酿酒酵母（CGMCC 2.3973）为测试菌株通过抑菌圈实验和最小抑菌浓度测定验证预测结果,得到4条具有抗菌活性的肽段...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
1.1 花椒简介
1.2 花椒籽及其应用研究现状
1.2.1 花椒籽的主要成分
1.2.1.1 油脂
1.2.1.2 蛋白质
1.2.1.3 黑色素
1.2.1.4 膳食纤维
1.2.2 花椒籽的功能性质及开发利用
1.3 抗菌肽及其获得方式
1.3.1 抗菌肽的分类
1.3.2 抗菌肽的理化性质与生物学功能
1.3.3 抗菌肽的获得方式
1.4 影响抗菌肽活性的因素
1.4.1 抗菌肽的序列长度
1.4.2 抗菌肽的正电荷性
1.4.3 抗菌肽的两亲性
1.4.4 抗菌肽的疏水性
1.4.5 抗菌肽的螺旋度
1.4.6 二硫键、铰链结构
1.4.7 氨基酸构型
1.5 抗菌肽的作用机制
1.5.1 膜损伤机制
1.5.2 非膜损伤机制
1.6 生物信息学、多肽组学在抗菌肽研究中的应用
1.7 抗菌肽的应用
1.7.1 在农业、畜牧业上的应用
1.7.2 在食品工业上的应用
1.7.3 在医药领域的应用
1.8 本研究目的意义、主要内容及技术路线
1.8.1 本研究的目的意义
1.8.2 本研究的主要内容
1.8.3 本研究的技术路线
第二章 基于生物信息学与多肽组学的花椒籽抗菌肽的筛选鉴定
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料、试剂及主要仪器
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 花椒籽蛋白及其酶解液的制备
2.2.2.2 多肽样品的初步纯化
2.2.2.3 Nano LC-ESI-MS/MS分离鉴定花椒籽蛋白酶解液中的多肽
2.2.2.4 序列分析
2.2.2.5 疑似抗菌肽的预测
2.2.2.6 疑似抗菌肽的化学合成
2.2.2.7 抗菌活性的验证
2.2.2.8 杀菌动力曲线的测定
2.3 结果与分析
2.3.1 Nano LC-ESI-MS/MS结果
2.3.2 疑似抗菌肽预测
2.3.3 验证实验
2.3.4 杀菌动力曲线测定
2.4 讨论
2.4.1 生物信息学在生物活性多肽研究中的应用
2.4.2 三磷酸甘油醛脱氢酶在生物体防御系统中的作用
2.5 小结
第三章 花椒籽抗菌肽的性质研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料、试剂及主要仪器
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 花椒籽抗菌肽的理化性质预测
3.2.2.2 花椒籽抗菌肽空间结构的模拟
3.2.2.3 圆二色谱测定花椒籽抗菌肽的二级结构
3.2.2.4 溶血活性的测定
3.2.2.5 加热温度对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.6 反复冻融对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.7 紫外灯照射对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.8 pH对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.9 盐离子对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.10 蛋白酶对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.3 结果与分析
3.3.1 花椒籽抗菌肽的理化性质预测
3.3.2 花椒籽抗菌肽的空间结构模拟
3.3.3 花椒籽抗菌肽的二级结构测定
3.3.4 花椒籽抗菌肽的溶血活性测定
3.3.5 花椒籽抗菌肽的热稳定性
3.3.6 花椒籽抗菌肽的冻融稳定性
3.3.7 花椒籽抗菌肽的紫外照射稳定性
3.3.8 花椒籽抗菌肽的pH稳定性
3.3.9 花椒籽抗菌肽的盐离子稳定性
3.3.10 蛋白酶对花椒籽抗菌肽活性的影响
3.3.10.1 胃蛋白酶的影响
3.3.10.2 胰蛋白酶的影响
3.3.10.3 蛋白酶K的影响
3.4 讨论
3.4.1 花椒籽抗菌肽的溶血活性
3.4.2 花椒籽抗菌肽的结构特征与其功能的关系
3.4.3 花椒籽抗菌肽的稳定性研究
3.5 小结
第四章 花椒籽抗菌肽NP-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料、试剂及主要仪器
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 NP-6 对细菌表面特性的影响
4.2.2.2 NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.2.2.3 NP-6 与细菌核酸的相互作用
4.2.2.4 NP-6 对细菌胞内酶活性的影响
4.3 结果与分析
4.3.1 NP-6 对细菌表面特性的影响
4.3.1.1 NP-6 对细菌表面Zeta电位的影响
4.3.1.2 扫描电镜观察NP-6 处理后细菌表面形态变化
4.3.2 NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.3.2.1 透射电镜观察NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.3.2.2 NP-6 对细菌细胞膜通透性的影响
4.3.2.3 流式细胞仪分析NP-6 对细菌细胞膜完整性的影响
4.3.2.4 激光共聚焦显微镜观察NP-6 对细菌细胞膜完整性的影响
4.3.3 NP-6 对细菌核酸的影响
4.3.3.1 NP-6 与溴化乙锭竞争性结合细菌基因组DNA的荧光光谱分析
4.3.3.2 DNA-肽结合凝胶阻滞试验
4.3.3.3 RNA-肽结合凝胶阻滞试验
4.3.4 NP-6 对细菌胞内酶活的影响
4.4 讨论
4.4.1 抗菌肽NP-6 对细菌细胞膜的破坏作用
4.4.2 抗菌肽NP-6 的胞内靶点
4.5 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
5.3 论文创新点
参考文献
致谢
作者简历
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]四川花椒产业发展现状及对策分析研究[J]. 王丽华,赵卫红,彭晓曦,秦茂,熊量,吴宗兴. 四川林业科技. 2018(02)
[2]家蝇天蚕素抗菌肽Cec4对鲍曼不动杆菌抑菌活性的研究[J]. 龙慧玲,杨举豪,彭建,吴建伟. 中华微生物学和免疫学杂志. 2017 (12)
[3]响应面法优化花椒籽仁蛋白质盐提工艺条件[J]. 李超,蒲彪,刘兴艳,徐丹萍,罗松明,王春霞,蒋培基,潘姝璇,李强,付本宁. 中国油脂. 2017(06)
[4]不同产地红花椒籽油脂肪酸组成的比较研究[J]. 张仁凤,陈光静,屈立武,阚建全. 中国调味品. 2017(06)
[5]花椒籽黑色素化学结构的初步研究[J]. 张伟,吴博. 中国测试. 2017(03)
[6]几种豆科植物抗菌肽的生物信息学预测与分析[J]. 邹谋勇,朱新贵. 中国酿造. 2016(10)
[7]花椒研究概况[J]. 陈旅,杨途熙,魏安智,冯世静,刘永红. 中国调味品. 2016(10)
[8]抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制[J]. 陈飞龙,刘渔珠,彭勃,陈咏春,苗建银,曹庸. 食品科学. 2017(06)
[9]花椒籽粉对肉鸡生产性能、免疫器官指数及肉品质的影响[J]. 付兴周,路志芳,申海燕. 河南农业科学. 2016(09)
[10]花椒籽黑色素体外抗氧化能力研究[J]. 董小华,课敬璇,申光辉,黎杉珊,张志清. 中国油脂. 2016(08)
博士论文
[1]α-螺旋型膜活性多肽对不同细胞膜的构效关系及作用机理研究[D]. 黄金丰.吉林大学 2011
[2]BuforinⅡ抗菌肽的分子设计及对DNA作用抑菌机理研究[D]. 郝刚.江南大学 2009
[3]新疆家蚕抗菌肽结构与功能的关系及抗菌作用机理的研究[D]. 刘忠渊.新疆大学 2008
硕士论文
[1]速激肽来源抗菌肽的促伤口愈合活性研究[D]. 李思思.兰州大学 2017
[2]花椒嫁接砧木对形态和结实的影响[D]. 安晓龙.四川农业大学 2014
[3]四川花椒品种选育评价指标体系构建[D]. 赵琼慧.四川农业大学 2014
[4]花椒籽油制备生物柴油的工艺研究[D]. 黄文捷.西北农林科技大学 2008
[5]花椒籽蛋白质分离提取及功能性质的研究[D]. 寇明钰.西南大学 2006
本文编号：3193760
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：129 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
1.1 花椒简介
1.2 花椒籽及其应用研究现状
1.2.1 花椒籽的主要成分
1.2.1.1 油脂
1.2.1.2 蛋白质
1.2.1.3 黑色素
1.2.1.4 膳食纤维
1.2.2 花椒籽的功能性质及开发利用
1.3 抗菌肽及其获得方式
1.3.1 抗菌肽的分类
1.3.2 抗菌肽的理化性质与生物学功能
1.3.3 抗菌肽的获得方式
1.4 影响抗菌肽活性的因素
1.4.1 抗菌肽的序列长度
1.4.2 抗菌肽的正电荷性
1.4.3 抗菌肽的两亲性
1.4.4 抗菌肽的疏水性
1.4.5 抗菌肽的螺旋度
1.4.6 二硫键、铰链结构
1.4.7 氨基酸构型
1.5 抗菌肽的作用机制
1.5.1 膜损伤机制
1.5.2 非膜损伤机制
1.6 生物信息学、多肽组学在抗菌肽研究中的应用
1.7 抗菌肽的应用
1.7.1 在农业、畜牧业上的应用
1.7.2 在食品工业上的应用
1.7.3 在医药领域的应用
1.8 本研究目的意义、主要内容及技术路线
1.8.1 本研究的目的意义
1.8.2 本研究的主要内容
1.8.3 本研究的技术路线
第二章 基于生物信息学与多肽组学的花椒籽抗菌肽的筛选鉴定
2.1 前言
2.2 材料与方法
2.2.1 材料、试剂及主要仪器
2.2.2 实验方法
2.2.2.1 花椒籽蛋白及其酶解液的制备
2.2.2.2 多肽样品的初步纯化
2.2.2.3 Nano LC-ESI-MS/MS分离鉴定花椒籽蛋白酶解液中的多肽
2.2.2.4 序列分析
2.2.2.5 疑似抗菌肽的预测
2.2.2.6 疑似抗菌肽的化学合成
2.2.2.7 抗菌活性的验证
2.2.2.8 杀菌动力曲线的测定
2.3 结果与分析
2.3.1 Nano LC-ESI-MS/MS结果
2.3.2 疑似抗菌肽预测
2.3.3 验证实验
2.3.4 杀菌动力曲线测定
2.4 讨论
2.4.1 生物信息学在生物活性多肽研究中的应用
2.4.2 三磷酸甘油醛脱氢酶在生物体防御系统中的作用
2.5 小结
第三章 花椒籽抗菌肽的性质研究
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料、试剂及主要仪器
3.2.2 实验方法
3.2.2.1 花椒籽抗菌肽的理化性质预测
3.2.2.2 花椒籽抗菌肽空间结构的模拟
3.2.2.3 圆二色谱测定花椒籽抗菌肽的二级结构
3.2.2.4 溶血活性的测定
3.2.2.5 加热温度对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.6 反复冻融对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.7 紫外灯照射对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.8 pH对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.9 盐离子对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.2.2.10 蛋白酶对花椒籽抗菌肽抗菌活性的影响
3.3 结果与分析
3.3.1 花椒籽抗菌肽的理化性质预测
3.3.2 花椒籽抗菌肽的空间结构模拟
3.3.3 花椒籽抗菌肽的二级结构测定
3.3.4 花椒籽抗菌肽的溶血活性测定
3.3.5 花椒籽抗菌肽的热稳定性
3.3.6 花椒籽抗菌肽的冻融稳定性
3.3.7 花椒籽抗菌肽的紫外照射稳定性
3.3.8 花椒籽抗菌肽的pH稳定性
3.3.9 花椒籽抗菌肽的盐离子稳定性
3.3.10 蛋白酶对花椒籽抗菌肽活性的影响
3.3.10.1 胃蛋白酶的影响
3.3.10.2 胰蛋白酶的影响
3.3.10.3 蛋白酶K的影响
3.4 讨论
3.4.1 花椒籽抗菌肽的溶血活性
3.4.2 花椒籽抗菌肽的结构特征与其功能的关系
3.4.3 花椒籽抗菌肽的稳定性研究
3.5 小结
第四章 花椒籽抗菌肽NP-6对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌机理研究
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料、试剂及主要仪器
4.2.2 实验方法
4.2.2.1 NP-6 对细菌表面特性的影响
4.2.2.2 NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.2.2.3 NP-6 与细菌核酸的相互作用
4.2.2.4 NP-6 对细菌胞内酶活性的影响
4.3 结果与分析
4.3.1 NP-6 对细菌表面特性的影响
4.3.1.1 NP-6 对细菌表面Zeta电位的影响
4.3.1.2 扫描电镜观察NP-6 处理后细菌表面形态变化
4.3.2 NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.3.2.1 透射电镜观察NP-6 对细菌细胞膜的影响
4.3.2.2 NP-6 对细菌细胞膜通透性的影响
4.3.2.3 流式细胞仪分析NP-6 对细菌细胞膜完整性的影响
4.3.2.4 激光共聚焦显微镜观察NP-6 对细菌细胞膜完整性的影响
4.3.3 NP-6 对细菌核酸的影响
4.3.3.1 NP-6 与溴化乙锭竞争性结合细菌基因组DNA的荧光光谱分析
4.3.3.2 DNA-肽结合凝胶阻滞试验
4.3.3.3 RNA-肽结合凝胶阻滞试验
4.3.4 NP-6 对细菌胞内酶活的影响
4.4 讨论
4.4.1 抗菌肽NP-6 对细菌细胞膜的破坏作用
4.4.2 抗菌肽NP-6 的胞内靶点
4.5 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
5.3 论文创新点
参考文献
致谢
作者简历
附录
【参考文献】：
期刊论文
[1]四川花椒产业发展现状及对策分析研究[J]. 王丽华,赵卫红,彭晓曦,秦茂,熊量,吴宗兴. 四川林业科技. 2018(02)
[2]家蝇天蚕素抗菌肽Cec4对鲍曼不动杆菌抑菌活性的研究[J]. 龙慧玲,杨举豪,彭建,吴建伟. 中华微生物学和免疫学杂志. 2017 (12)
[3]响应面法优化花椒籽仁蛋白质盐提工艺条件[J]. 李超,蒲彪,刘兴艳,徐丹萍,罗松明,王春霞,蒋培基,潘姝璇,李强,付本宁. 中国油脂. 2017(06)
[4]不同产地红花椒籽油脂肪酸组成的比较研究[J]. 张仁凤,陈光静,屈立武,阚建全. 中国调味品. 2017(06)
[5]花椒籽黑色素化学结构的初步研究[J]. 张伟,吴博. 中国测试. 2017(03)
[6]几种豆科植物抗菌肽的生物信息学预测与分析[J]. 邹谋勇,朱新贵. 中国酿造. 2016(10)
[7]花椒研究概况[J]. 陈旅,杨途熙,魏安智,冯世静,刘永红. 中国调味品. 2016(10)
[8]抗菌肽F1对金黄色葡萄球菌的胞内作用机制[J]. 陈飞龙,刘渔珠,彭勃,陈咏春,苗建银,曹庸. 食品科学. 2017(06)
[9]花椒籽粉对肉鸡生产性能、免疫器官指数及肉品质的影响[J]. 付兴周,路志芳,申海燕. 河南农业科学. 2016(09)
[10]花椒籽黑色素体外抗氧化能力研究[J]. 董小华,课敬璇,申光辉,黎杉珊,张志清. 中国油脂. 2016(08)
博士论文
[1]α-螺旋型膜活性多肽对不同细胞膜的构效关系及作用机理研究[D]. 黄金丰.吉林大学 2011
[2]BuforinⅡ抗菌肽的分子设计及对DNA作用抑菌机理研究[D]. 郝刚.江南大学 2009
[3]新疆家蚕抗菌肽结构与功能的关系及抗菌作用机理的研究[D]. 刘忠渊.新疆大学 2008
硕士论文
[1]速激肽来源抗菌肽的促伤口愈合活性研究[D]. 李思思.兰州大学 2017
[2]花椒嫁接砧木对形态和结实的影响[D]. 安晓龙.四川农业大学 2014
[3]四川花椒品种选育评价指标体系构建[D]. 赵琼慧.四川农业大学 2014
[4]花椒籽油制备生物柴油的工艺研究[D]. 黄文捷.西北农林科技大学 2008
[5]花椒籽蛋白质分离提取及功能性质的研究[D]. 寇明钰.西南大学 2006
本文编号：3193760
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