家猫pFLA Ⅰ -167W/S 和CD8αα精细结构与递呈抗原表位结构机理的研究

发布时间：2021-05-18 12:36

　　主要组织相容性复合体I（Major Histocompatibility Complex,MHCI）表达在有核细胞表面,递呈内源性抗原至CD8+T淋巴细胞,使其识别并清除病毒感染的细胞或癌细胞。近三十年来人和鼠MHC I类分子抗原加工和递呈的相关研究颇为广泛。但有关猫MHC I（Feline Leucocyte Antigen,FLA I）分子多态性的研究报道较少,尤其是在结构生物学领域的研究。猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus,FIV）是引起猫获得性免疫缺陷综合征的重要病原体,与人类免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus,HIV）同属于慢病毒属并具有相似的感染过程。因此,FIV/猫成为研究HIV感染的最小天然模型。MHC I分子能够呈递病毒多肽供细胞毒性T细胞识别,对于清除HIV等病毒的感染具有关键作用。但FLAI分子的结构和和功能并不清晰,则限制了对于抗FIV感染的深入研究。首先,本文通过PCR技术从12只家猫的外周血淋巴细胞中克隆了24条FLA I的E等位基因序列,进行多态性分析。将组成MHCI多肽结合槽（P... 

【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：120 页

【学位级别】：博士

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摘要
Abstract
缩略词表
第一章 引言
    1.1 MHC Ⅰ类分子的研究进展
        1.1.1 MHC分子的发现
        1.1.2 MHC Ⅰ类分子的功能
        1.1.3 病原和肿瘤逃逸MHC Ⅰ类分子递呈抗原策略
        1.1.4 MHC Ⅰ类分子的结构
        1.1.5 基于MHC技术检测抗原应答T细胞的研究进展
        1.1.6 猫MHC Ⅰ类分子的研究进展
        1.1.7 FIV的基因组结构和分子特征
        1.1.8 CD8分子的结构
    1.2 研究目的与意义
    1.3 研究内容和技术路线
    1.4 研究目标
第二章 FLA Ⅰ多态性分析
    2.1 引言
    2.2 材料
        2.2.1 猫
        2.2.2 载体及菌株
        2.2.3 主要试剂
        2.2.4 仪器设备
        2.2.5 常用溶液及试剂的配制
    2.3 方法
        2.3.1 引物设计
        2.3.2 猫外周血淋巴细胞的分离
        2.3.3 总RNA提取
        2.3.4 FLA Ⅰ基因克隆
        2.3.5 软件及公式
    2.4 结果
        2.4.1 FLA Ⅰ基因扩增与鉴定
        2.4.2 FLA Ⅰ基因序列的测定及分析
        2.4.3 FLA Ⅰ等位基因系统进化树分析
        2.4.4 FLA Ⅰ α1、α2和α3各区变异分析
    2.5 讨论
        2.5.1 FLA Ⅰ的克隆及其分子特征
        2.5.2 FLA Ⅰα1、α2和α3区氨基酸变异频率的分析
        2.5.3 高变异位点对FLA Ⅰ多肽递呈规律的影响
    2.6 小结
第三章 pFLA Ⅰ递呈抗原多肽功能机制研究
    3.1 引言
    3.2 材料
        3.2.1 载体与菌株
        3.2.2 引物设计与合成
        3.2.3 多肽的预测与合成
        3.2.4 主要试剂
        3.2.5 仪器设备
        3.2.6 常用溶液及配制
    3.3 方法
        3.3.1 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)表达载体的构建
        3.3.2 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)分子的表达
        3.3.3 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)包涵体的提取
        3.3.4 FLA-E~*01801_(-63E/N)或FLA-E~*01801_(-167W/S)、fβ2m及多肽的体外共复性与纯化
        3.3.5 FLA-E~*01801_(-167W/SRMA-PlD)蛋白结晶
        3.3.6 FLA-E~*01801_(-RMA)和FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)结构分析
    3.4 结果
        3.4.1 FLA-E~*01801_(-63E/N)和FLA-E~*01801_(-167W/S)胞外区成熟肽表达载体的构建
        3.4.2 FLA-E~*01801_(-63E/N)、FLA-E~*0180_(167W/S)、fβ2m蛋白表达
        3.4.3 FLA-E~*01801_(-167W/s-RMA-PlD)体外复性结果
        3.4.4 FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)复合物蛋白的结晶、数据收集及结构解析
        3.4.5 FLA-E~*01801_(-RMA9)和FLA-E~*01801_(-167W/S-RMA-PlD)蛋白晶体结构分析
    3.5 讨论
        3.5.1 A口袋的限制性
        3.5.2 A口袋限制性因素的分析
        3.5.3 FIV的抗原肽谱
    3.6 小结
第四章 pFLA Ⅰ结合基序的鉴定
    4.1 引言
    4.2 材料
        4.2.1 随机肽的合成
        4.2.2 FLA-E~*01801、fβ2m蛋白/分子生物学试剂/菌株/仪器
    4.3 方法
        4.3.1 FLA-E~*01801、fβ2m及随机多肽的体外复性及纯化
        4.3.2 随机多肽的处理
        4.3.3 色谱分离前样本处理
        4.3.4 LC-MS/MS检测
        4.3.5 高效液相色谱分离
        4.3.6 质谱分析
        4.3.7 多肽统计
    4.4 结果
        4.4.1 FLA-E~*01801/fβ2m/随机多肽的体外复性结果
        4.4.2 LC-MS/MS TIC和Base Peak谱图分析
        4.4.3 De Novo数据解析
        4.4.4 随机多肽谱图质量分析
        4.4.5 结合FLA-E~*01801的九肽每一位氨基酸的偏好性分析
    4.5 讨论
    4.6 小结
第五章 家猫CD8αα晶体结构研究
    5.1 引言
    5.2 材料
        5.2.1 设计引物
        5.2.2 合成编码猫CD8α链胞外区IgSF结构域的基因序列
        5.2.3 菌株及载体
        5.2.4 分子生物学试剂及仪器
    5.3 方法
    5.4 结果
        5.4.1 fCD8α蛋白表达
        5.4.2 fCD8αα蛋白的复性及纯化
        5.4.3 fCD8αα蛋白的结晶条件及晶体外观
        5.4.4 fCD8αα蛋白晶体衍射数据的收集
        5.4.5 fCD8αα蛋白晶体结构解析
        5.4.6 fCD8αα晶体结构分析
    5.5 讨论
        5.5.1 fCD8αα分子的结构特点
        5.5.2 fCD8αα的CDR1 loop具有刚性特征
    5.6 小结
第六章 结论
第七章 创新点
参考文献
致谢
个人简历



本文编号：3193800