大豆中主要抗原蛋白的HPLC和HPLC-MS/MS检测方法研究
发布时间：2021-06-30 09:04
大豆因其营养丰富而成为人类和动物优质的植物蛋白源。但是大豆产品中含有多种抗营养因子,会引起动物产生不良生理反应,尤其是幼龄动物。其中,β-伴大豆球蛋白的α亚基（GlymBd 60K）是主要的热稳定性大豆抗原蛋白,GlymBd28K是微量且免疫原性较强的大豆抗原蛋白,Kunitz型胰蛋白酶抑制因子是一种主要的热不稳定性大豆抗原蛋白。近几十年来,科研工作者致力于研究通过不同的加工工艺来消除或降低大豆中的抗营养因子,但由于技术水平和工艺参数等的不同,造成大豆产品质量良莠不齐,由于受到检测技术的限制,很难准确评价其钝化消除效果。因此,如何准确测定大豆中的抗营养因子水平已成为了大豆产品质量评定以及加工工艺监控等工作中必须解决的问题。因此,本研究旨在建立灵敏、准确的检测方法来测定GlymBd 60K、Glym Bd 28K和Kunitz型胰蛋白酶抑制因子,为评价不同加工工艺的大豆产品中抗原蛋白的消除钝化效果提供技术支撑。本研究分为四个试验,试验一:利用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱（High performance liquid chromatography-tanden mass spectr...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－５不同的酶解方法（膜上酶解法和溶液酶解法）的比较??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｒｙｐｔｉｃ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?（ｏｎ－ｆｉｌｔｅｒ?ａｎｄ?ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ）?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｓｏｙｂｅａｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ??ｅｘｔｒａｃｔ??
保留时间（ｍｉｎ）??Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?ｔｉｍｅ?（ｍｉｎ）??图２－７定置肋段在高分辨质谱下的提取离子流色谱图??Ｆｉｇｕｒｅ?２－７?Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ?ｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ?ｈｉｇｈ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｍａｓｓ??ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ??２．１．３．５质谱条件的优化??图２－８?（Ａ）为目标肽段标准品在全扫描模式下的质谱图。从图中可以看出，目标肽段带两个??正电荷，质荷比为５２６．３，且质谱响应信号最高，因此，本试验选择该离子作为母离子，并对传??输电压进行了优化，结果表明，当传输电压为１２０?Ｖ时，母离子的质谱响应信号最高（图２－９（Ａ）），??因此，本试验将１２０?Ｖ确定为传输电压。随后，本试验对母离子碎裂产生的相应子离子进行分析，??结果如图２－８?（Ｂ）所示，在Ｃ－端ｙ系列子离子中，ｙ５子离子（ｍ／ｚ?５８０．２＋１）的质谱响应信号最??高，而ｙ６子离子（ｍ／ｚ６９３＿３＋１）的质谱信号强度位居第二，且上述两个子离子附近均无其他干扰??子离子，因此，本试验将ｙ５子离子和ｙ６子离子作为定性子离子，而前者作为定量子离子。为了??提高方法灵敏度
通常以线性范围和定量限来评估方法的灵敏度。本方法中以各浓度下目标肽段标准品定量子??离子的峰面积对浓度作线性回归分析得到标准曲线。将目标肽段以起始流动相稀释，在１．６－５００??ｎｇ／ｍＬ范围内呈现良好的线性关系（图２－１１），相关系数为０．９９７３，目标肽段的检出限为０．５ｎｇ／ｍＬ，??目标肽段的定量限为１．６ｎｇ／ｍＬ。??方法的准确性和精确性主要通过样品添加回收试验来评估。本试验选择低Ｇｌｙｍ?Ｂｄ６０Ｋ含量??的发酵豆粕样品中添加不同浓度的目标肽段标准品，得到回收率。肽段的添加量的设定依据为５０??Ｈｇ生大豆蛋白完全酶解后，能够产生定量肽段平均含量６０?ｆｍｏｌ的０．５倍、１倍和２倍。回收率由目??３３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Solid-state fermentation of corn-soybean meal mixed feed with Bacillus subtilis and Enterococcus faecium for degrading antinutritional factors and enhancing nutritional value[J]. Changyou Shi,Yu Zhang,Zeqing Lu,Yizhen Wang. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2017(04)
[2]单酶水解豆芽蛋白及其产物的潜在致敏性[J]. 杨秀芝,王艳,杨安树,陈红兵. 食品安全质量检测学报. 2017(04)
[3]Fermented soybean meal improves the growth performance, nutrient digestibility, and microbial flora in piglets[J]. Lin Yuan,Juan Chang,Qingqiang Yin,Min Lu,Yuanran Di,Ping Wang,Zhixiang Wang,Erzhu Wang,Fushan Lu. Animal Nutrition. 2017(01)
[4]大豆饲料产品中主要抗营养因子含量的检测与分析[J]. 周天骄,谯仕彦,马曦,贺平丽. 动物营养学报. 2015 (01)
[5]大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化[J]. 谷春梅,韩玲玲,曲洪生,宋鑫秀,赵琳琳,潘姝,秦贵信. 大豆科学. 2013(01)
[6]发酵对豆粕中营养物质和抗营养因子的影响[J]. 姜丹,丁洪浩,张晶,沈景林,赵云. 中国兽医学报. 2011(04)
[7]豆粕中胰蛋白酶抑制剂间接竞争酶联免疫吸附检测方法的研究[J]. 邢春芳,葛向阳. 饲料工业. 2010(10)
[8]大豆中主要抗原蛋白的研究进展[J]. 秦贵信,孙泽威,赵元,王涛. 吉林农业大学学报. 2008(04)
[9]芯片实验室技术及其应用[J]. 刘晓为,张海峰,王蔚,田丽,王喜莲. 测试技术学报. 2006(06)
[10]蒸汽处理对纯化大豆抗原含量及免疫原性的影响[J]. 孙鹏,秦贵信. 中国兽医学报. 2006(05)
博士论文
[1]大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠过敏反应及其机理的研究[D]. 刘欣.浙江大学 2008
本文编号：3257456
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图２－５不同的酶解方法（膜上酶解法和溶液酶解法）的比较??Ｆｉｇｕｒｅ?２－５?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｔｒｙｐｔｉｃ?ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ?ｐａｔｔｅｒｎｓ?（ｏｎ－ｆｉｌｔｅｒ?ａｎｄ?ｉｎ－ｓｏｌｕｔｉｏｎ）?ｆｒｏｍ?ｔｈｅ?ｓｏｙｂｅａｎ?ｐｒｏｔｅｉｎ??ｅｘｔｒａｃｔ??
保留时间（ｍｉｎ）??Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ?ｔｉｍｅ?（ｍｉｎ）??图２－７定置肋段在高分辨质谱下的提取离子流色谱图??Ｆｉｇｕｒｅ?２－７?Ｅｘｔｒａｃｔｉｖｅ?ｉｏｎ?ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｓｔａｎｄａｒｄ?ｐｅｐｔｉｄｅ?ｄｅｔｅｃｔｅｄ?ｂｙ?Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ?ｈｉｇｈ?ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ?ｍａｓｓ??ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ??２．１．３．５质谱条件的优化??图２－８?（Ａ）为目标肽段标准品在全扫描模式下的质谱图。从图中可以看出，目标肽段带两个??正电荷，质荷比为５２６．３，且质谱响应信号最高，因此，本试验选择该离子作为母离子，并对传??输电压进行了优化，结果表明，当传输电压为１２０?Ｖ时，母离子的质谱响应信号最高（图２－９（Ａ）），??因此，本试验将１２０?Ｖ确定为传输电压。随后，本试验对母离子碎裂产生的相应子离子进行分析，??结果如图２－８?（Ｂ）所示，在Ｃ－端ｙ系列子离子中，ｙ５子离子（ｍ／ｚ?５８０．２＋１）的质谱响应信号最??高，而ｙ６子离子（ｍ／ｚ６９３＿３＋１）的质谱信号强度位居第二，且上述两个子离子附近均无其他干扰??子离子，因此，本试验将ｙ５子离子和ｙ６子离子作为定性子离子，而前者作为定量子离子。为了??提高方法灵敏度
通常以线性范围和定量限来评估方法的灵敏度。本方法中以各浓度下目标肽段标准品定量子??离子的峰面积对浓度作线性回归分析得到标准曲线。将目标肽段以起始流动相稀释，在１．６－５００??ｎｇ／ｍＬ范围内呈现良好的线性关系（图２－１１），相关系数为０．９９７３，目标肽段的检出限为０．５ｎｇ／ｍＬ，??目标肽段的定量限为１．６ｎｇ／ｍＬ。??方法的准确性和精确性主要通过样品添加回收试验来评估。本试验选择低Ｇｌｙｍ?Ｂｄ６０Ｋ含量??的发酵豆粕样品中添加不同浓度的目标肽段标准品，得到回收率。肽段的添加量的设定依据为５０??Ｈｇ生大豆蛋白完全酶解后，能够产生定量肽段平均含量６０?ｆｍｏｌ的０．５倍、１倍和２倍。回收率由目??３３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Solid-state fermentation of corn-soybean meal mixed feed with Bacillus subtilis and Enterococcus faecium for degrading antinutritional factors and enhancing nutritional value[J]. Changyou Shi,Yu Zhang,Zeqing Lu,Yizhen Wang. Journal of Animal Science and Biotechnology. 2017(04)
[2]单酶水解豆芽蛋白及其产物的潜在致敏性[J]. 杨秀芝,王艳,杨安树,陈红兵. 食品安全质量检测学报. 2017(04)
[3]Fermented soybean meal improves the growth performance, nutrient digestibility, and microbial flora in piglets[J]. Lin Yuan,Juan Chang,Qingqiang Yin,Min Lu,Yuanran Di,Ping Wang,Zhixiang Wang,Erzhu Wang,Fushan Lu. Animal Nutrition. 2017(01)
[4]大豆饲料产品中主要抗营养因子含量的检测与分析[J]. 周天骄,谯仕彦,马曦,贺平丽. 动物营养学报. 2015 (01)
[5]大豆胰蛋白酶抑制因子的分离纯化[J]. 谷春梅,韩玲玲,曲洪生,宋鑫秀,赵琳琳,潘姝,秦贵信. 大豆科学. 2013(01)
[6]发酵对豆粕中营养物质和抗营养因子的影响[J]. 姜丹,丁洪浩,张晶,沈景林,赵云. 中国兽医学报. 2011(04)
[7]豆粕中胰蛋白酶抑制剂间接竞争酶联免疫吸附检测方法的研究[J]. 邢春芳,葛向阳. 饲料工业. 2010(10)
[8]大豆中主要抗原蛋白的研究进展[J]. 秦贵信,孙泽威,赵元,王涛. 吉林农业大学学报. 2008(04)
[9]芯片实验室技术及其应用[J]. 刘晓为,张海峰,王蔚,田丽,王喜莲. 测试技术学报. 2006(06)
[10]蒸汽处理对纯化大豆抗原含量及免疫原性的影响[J]. 孙鹏,秦贵信. 中国兽医学报. 2006(05)
博士论文
[1]大豆球蛋白glycinin和β-conglycinin引发Balb/c小鼠过敏反应及其机理的研究[D]. 刘欣.浙江大学 2008
本文编号：3257456
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