山羊IL-17A的可溶性表达与单克隆抗体制备及其对山羊乳腺上皮细胞作用的研究
发布时间：2021-07-21 20:13
白细胞介素-17（Interleukin-17,IL-17）是Th17细胞的特征性细胞因子,被认为是一种关键的促炎性细胞因子,在宿主抵抗胞外菌、真菌感染,以及炎症、超敏反应、自身免疫病等多种疾病过程中均起到了重要的作用。山羊的很多炎症性疾病如乳腺炎是损害山羊健康,制约养羊业健康发展的重要因素。但IL-17与山羊乳腺炎等炎症性疾病之间关系的基础研究还比较少,缺乏有效的山羊IL-17单克隆抗体是阻碍IL-17相关山羊疾病机理深入研究的一个重要原因。本研究根据Gen Bank公布的奶山羊IL-17A CDS区序列（不含信号肽序列）设计原核表达引物,从Con A活化的奶山羊外周血单个核细胞中提取细胞总RNA,反转录PCR法扩增目的基因,连接到原核表达载体p ET 32a后将重组质粒转入大肠杆菌Tans B（DE3）感受态细胞进行原核表达,并对原核表达条件进行了优化,实现目的蛋白的可溶性表达,并对纯化条件进行了优化。随后,本研究以纯化的原核表达重组山羊IL-17A（r IL-17A）免疫BABL/c小鼠,使用免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞融合,最终筛选出能分泌抗羊IL-17A单克隆抗体的融合杂...
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
IL-17受体信号转导通路图（引自(Gaffen2009)）
文献综述3要的作用(Changetal.2006)。Act1也可以激活有丝分裂原活化的蛋白激酶家族(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，该家族能够进一步活化激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)(Changetal.2006)。图1-1IL-17及受体家族（引自(Gaffen2009)）Figure1-1IL-17ligandandreceptorfamilymembers图1-2IL-17受体信号转导通路图（引自(Gaffen2009)）Figure1-2IL-17receptorsignaltransduction
第二章山羊IL-17A基因的克隆与原核表达21槽，加入预冷的膜转移Buffer和冰盒，并且在槽外用冰块覆盖降温，90V湿转85min；（3）封闭：放入含5%脱脂乳的PBST中室温封闭2h，PBST洗膜3次，（4）孵育一抗：放入PBST稀释的一抗（MouseAnti-Histagantibody，含1%脱脂，1:5000稀释），4℃平缓摇动孵育过夜；（5）孵育二抗：用PBST漂洗膜3次，放入PBST稀释的二抗（GoatAnti-MouseIgG/HRPantibody，含1%脱脂，1:5000稀释），室温缓慢摇动孵育1h；（6）显色：取出膜，用PBST漂洗膜3次，加入ECL溶液进行显色。2.3结果与分析2.3.1山羊IL-17A无信号肽CDS区PCR扩增结果PBMCs经ConA刺激后提取总RNA，反转录扩增IL-17A基因编码区（不含信号肽部分），在400bp位置左右出现扩增片段，与目的片段预期大小（393bp）相符（图2-1）。图2-1山羊IL-17ACDS区扩增结果Figure2-1CloningoftheCDSregionofgoatIL-17AM,DNAMarkerDL500;N,阴性对照;1,山羊IL-17APCR扩增产物。M,DNAMarkerDL500;N,negativecontrol;Lane1,PCRproductsofgoatIL-17A.2.3.2重组质粒菌液PCR鉴定结果目的基因片段与pET32a原核表达载体连接后，将重组质粒转化入大肠杆菌TransB(DE3)，经过菌液PCR鉴定，扩增出与目的基因大小相符的片段（图2-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶山羊实验性乳房炎的病理组织学观察及促炎性细胞因子的检测[J]. 韩炎森,牟珊,陈德坤. 动物医学进展. 2011(08)
[2]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[3]A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17 and IL-17F regulates inflammatory responses[J]. Seon Hee Chang. Cell Research. 2007(05)
博士论文
[1]奶山羊隐性乳腺炎的流行病学调查及S.aureus感染小鼠乳腺后Th细胞免疫应答机制研究[D]. 赵燕清.西北农林科技大学 2015
硕士论文
[1]山羊IL-17单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 桑锋锋.西北农林科技大学 2017
[2]我国奶山羊主要养殖省份隐性乳房炎的调查及病原菌多重PCR检测方法的建立[D]. 姚运亮.西北农林科技大学 2013
[3]奶山羊Th17细胞主要效应分子的克隆表达[D]. 赵莉娟.西北农林科技大学 2011
[4]奶山羊乳腺上皮细胞系的建立及脂肪酸合酶基因的RNA干扰研究[D]. 王伟.西北农林科技大学 2009
本文编号：3295696
【文章来源】：西北农林科技大学陕西省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：98 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
IL-17受体信号转导通路图（引自(Gaffen2009)）
文献综述3要的作用(Changetal.2006)。Act1也可以激活有丝分裂原活化的蛋白激酶家族(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)，该家族能够进一步活化激活蛋白-1(activatorprotein-1，AP-1)(Changetal.2006)。图1-1IL-17及受体家族（引自(Gaffen2009)）Figure1-1IL-17ligandandreceptorfamilymembers图1-2IL-17受体信号转导通路图（引自(Gaffen2009)）Figure1-2IL-17receptorsignaltransduction
第二章山羊IL-17A基因的克隆与原核表达21槽，加入预冷的膜转移Buffer和冰盒，并且在槽外用冰块覆盖降温，90V湿转85min；（3）封闭：放入含5%脱脂乳的PBST中室温封闭2h，PBST洗膜3次，（4）孵育一抗：放入PBST稀释的一抗（MouseAnti-Histagantibody，含1%脱脂，1:5000稀释），4℃平缓摇动孵育过夜；（5）孵育二抗：用PBST漂洗膜3次，放入PBST稀释的二抗（GoatAnti-MouseIgG/HRPantibody，含1%脱脂，1:5000稀释），室温缓慢摇动孵育1h；（6）显色：取出膜，用PBST漂洗膜3次，加入ECL溶液进行显色。2.3结果与分析2.3.1山羊IL-17A无信号肽CDS区PCR扩增结果PBMCs经ConA刺激后提取总RNA，反转录扩增IL-17A基因编码区（不含信号肽部分），在400bp位置左右出现扩增片段，与目的片段预期大小（393bp）相符（图2-1）。图2-1山羊IL-17ACDS区扩增结果Figure2-1CloningoftheCDSregionofgoatIL-17AM,DNAMarkerDL500;N,阴性对照;1,山羊IL-17APCR扩增产物。M,DNAMarkerDL500;N,negativecontrol;Lane1,PCRproductsofgoatIL-17A.2.3.2重组质粒菌液PCR鉴定结果目的基因片段与pET32a原核表达载体连接后，将重组质粒转化入大肠杆菌TransB(DE3)，经过菌液PCR鉴定，扩增出与目的基因大小相符的片段（图2-2）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]奶山羊实验性乳房炎的病理组织学观察及促炎性细胞因子的检测[J]. 韩炎森,牟珊,陈德坤. 动物医学进展. 2011(08)
[2]奶山羊乳腺上皮细胞的分离、培养及鉴定[J]. 王桢,罗军,王伟,赵旺生,林先滋. 生物工程学报. 2010(08)
[3]A novel heterodimeric cytokine consisting of IL-17 and IL-17F regulates inflammatory responses[J]. Seon Hee Chang. Cell Research. 2007(05)
博士论文
[1]奶山羊隐性乳腺炎的流行病学调查及S.aureus感染小鼠乳腺后Th细胞免疫应答机制研究[D]. 赵燕清.西北农林科技大学 2015
硕士论文
[1]山羊IL-17单克隆抗体的制备与鉴定[D]. 桑锋锋.西北农林科技大学 2017
[2]我国奶山羊主要养殖省份隐性乳房炎的调查及病原菌多重PCR检测方法的建立[D]. 姚运亮.西北农林科技大学 2013
[3]奶山羊Th17细胞主要效应分子的克隆表达[D]. 赵莉娟.西北农林科技大学 2011
[4]奶山羊乳腺上皮细胞系的建立及脂肪酸合酶基因的RNA干扰研究[D]. 王伟.西北农林科技大学 2009
本文编号：3295696
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