棉花（Gossypium hirsutum）DREB/CBF基因的筛选鉴定及其在植物抗逆应答中的功能研究
发布时间：2021-08-18 07:00
棉花是世界上最重要的经济作物之一,但随着全球生态环境的日益恶化,干旱、盐渍、低温等非生物胁迫常常对棉花生产造成重大损失,是限制棉花产量增加的主要环境因素。为解决这一农业问题,通过基因工程手段,发掘棉花抗逆相关的重要功能基因,并将这些基因导入植物基因组,进而获得抗逆新品种,是应对逆境胁迫,提高棉花产量的最为有效途径之一。研究表明,过量表达特定的胁迫应答转录因子,可以调控下游多个抗逆功能基因的表达,对于提高作物抗逆性具有重要作用。DREB/CBF （Dehydration Responsive Element Binding Protein/C-repeat Binding Factor）是一类重要的植物转录因子,在植物响应逆境胁迫应答以及抗逆过程中扮演重要角色。与拟南芥和水稻等传统模式植物相比,棉花抗逆性转录因子的鉴定和抗逆机制的研究还比较少。因此,筛选和鉴定棉花抗逆相关的DREB/CBF基因,分析揭示其抗逆分子机制,通过基因工程手段来改良提高棉花的抗逆性,对于我国棉花生产具有重要意义。本文运用生物信息学方法对棉花DREB/CBF基因进行筛选鉴定,分析这些基因的结构特点、进化关系以及干旱...
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：135 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 植物抗逆的机制
1.1.1 盐和干旱胁迫对植物的危害
1.1.2 植物适应盐和干旱胁迫的生理机制
1.1.3 植物对干旱和盐胁迫的信号应答机制
1.2 植物非生物胁迫转录因子DREB/CBF的研究进展
1.2.1 植物AP2/ERF转录因子家族
1.2.2 植物DREB/CBF转录因子的结构特征
1.2.3 植物DREB/CBF转录因子基因的生物学功能
1.2.4 植物DREB/CBF转录因子基因的表达调控
1.2.5 DREB/CBF转录因子在植物抗逆工程中的应用
1.3 棉花DREB/CBF基因的研究进展
1.4 立题依据及研究意义
第二章 棉花CBF基因筛选鉴定和表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 工具酶
2.1.3 常用的化学试剂
2.1.4 常用储液和缓冲液
2.1.5 MS培养基
2.1.6 PCR扩增引物及试剂
2.2 实验器材
2.3 实验方法
2.3.1 GhCBF基因的电子克隆及生物信息学分析
2.3.2 GhCBF基因的序列分析
2.3.3 棉花无菌苗的培养及材料的收取
2.3.4 棉花总RNA提取、纯化以及逆转录反应
2.3.5 实时定量RT-PCR分析
2.4 实验结果
2.4.1 GhCBF基因筛选鉴定
2.4.2 GhCBF基因的进化树分析
2.4.3 GhCBF基因的鉴定和序列分析
2.4.4 GhCBF基因在冷胁迫条件下的表达分析
2.4.5 GhCBF基因在干旱胁迫条件下的表达分析
2.4.6 GhCBF基因在盐胁迫条件下的表达分析
2.4.7 GhCBF基因在各组织中的表达分析
2.5 讨论
第三章 棉花GHCBF3基因分离鉴定和表达分析
3.1 实验材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 菌株和载体
3.1.3 工具酶
3.1.4 常用的化学试剂和试剂盒
3.1.5 常用储液和缓冲液
3.1.6 培养基
3.1.7 棉花基因组DNA提取试剂
3.1.8 PCR扩增引物及试剂
3.1.9 DNA测序
3.2 实验器材
3.3 实验方法
3.3.1 DNA及蛋白质序列分析
3.3.2 棉花无菌苗的培养及材料的收取
3.3.3 棉花基因组DNA的提取
3.3.4 拟南芥的培养
3.3.5 棉花和拟南芥总RNA提取、纯化以及逆转录反应
3.3.6 实时定量RT-PCR分析
3.3.7 GhCBF3基因全长序列的克隆
3.3.8 GhCBF3：eGFP载体构建和亚细胞定位分析
3.3.9 GhCBF3基因启动子全长序列的克隆
3.3.10 GhCBF3基因自激活检测
3.4 实验结果
3.4.1 GhCBF3基因的分离、鉴定和序列分析
3.4.2 GhCBF3基因的进化树分析
3.4.3 GhCBF3基因在棉花各组织中的表达分析
3.4.4 GhCBF3基因受盐、干旱和ABA的诱导表达
3.4.5 GhCBF3蛋白的亚细胞定位分析
3.4.6 GhCBF3自激活分析
3.4.7 GhCBF3基因启动子受盐和干旱胁迫诱导
3.5 讨论
第四章 棉花GHCBF3基因的抗逆功能分析
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株和载体
4.1.3 工具酶
4.1.4 常用的化学试剂
4.1.5 常用储液和缓冲液
4.1.6 培养基
4.1.7 PCR扩增引物、试剂
4.2 实验器材
4.3 实验方法
4.3.1 拟南芥的培养
4.3.2 GhCBF3过量表达载体的构建
4.3.3 过量表达GhCBF3基因拟南芥的转化和阳性苗PCR检测
4.3.4 过量表达GhCBF3基因拟南芥RNA水平检测表达量
4.3.5 拟南芥的非生物胁迫处理方法
4.3.6 拟南芥生理指标测定方法
4.3.7 拟南芥气孔导度测定方法
4.3.8 qRT-PCR分析ABA相关基因的表达
4.4 实验结果
4.4.1 gDNA和RNA水平检测转基因拟南芥中GhCBF3基因的表达
4.4.2 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥耐盐性分析
4.4.3 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥抗旱性
4.4.4 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥对ABA的敏感性
4.4.5 过量表达GhCBF3基因对拟南芥ABA和抗性相关基因的表达分析
4.5 讨论
第五章 棉花GHCBF2基因的克隆、鉴定和抗逆功能分析
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 菌株载体和工具酶
5.1.3 常用的化学试剂
5.1.4 常用储液、缓冲液和培养基
5.1.5 PCR扩增引物、试剂
5.2 实验方法
5.2.1 GhCBF2过量表达载体的构建
5.2.2 过量表达GhCBF2基因拟南芥的转化和阳性苗PCR检测
5.2.3 拟南芥的非生物胁迫处理方法
5.2.4 拟南芥生理指标测定方法
5.2.5 qRT-PCR分析ABA相关基因的表达
5.3 实验结果
5.3.1 GhCBF2基因的诱导表达分析
5.3.2 GhCBF2基因的克隆
5.3.3 GhCBF2基因鉴定和序列分析
5.3.4 GhCBF2进化树分析
5.3.5 GhCBF2基因的组织表达分析
5.3.6 GhCBF2蛋白亚细胞定位分析
5.3.7 过量表达GhCBF2基因拟南芥阳性苗gDNA和RNA水平检测
5.3.8 过量表达GhCBF2基因提高逆境条件下拟南芥种子萌发率
5.3.9 过量表达GhCBF2基因提高拟南芥幼苗抗逆性
5.3.10 过量表达GhCBF2基因提高拟南芥抗逆性
5.3.11 过量表达GhCBF2基因抗性生理指标测定
5.3.12 过量表达GhCBF2基因拟南芥抗逆相关基因的表达分析
5.4 讨论
结论
本论文的主要创新点
参考文献
附录
博士期间撰写和发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Improved salt tolerance of Populus davidiana × P. bolleana overexpressed LEA from Tamarix androssowii[J]. Yanshuang Sun,Su Chen,Haijiao Huang,Jing Jiang,Shuang Bai,Guifeng Liu. Journal of Forestry Research. 2014(04)
[2]DREB/CBF基因响应植物抗冷途径的研究进展[J]. 刘杰,马欣,董凤丽,周蕴薇. 林业科技. 2013(03)
[3]藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选[J]. 陈莎莎,贺转转,姜生秀,李晓荣,邢佳佳,吕秀云,兰海燕. 中国农业科学. 2013(05)
[4]盐生植物耐盐分子机制的研究进展[J]. 付畅,孙玉刚,傅桂荣. 生物技术通报. 2013(01)
[5]PYR/PYL/RCAR蛋白介导植物ABA的信号转导[J]. 胡帅,王芳展,刘振宁,刘亚培,余小林. 遗传. 2012(05)
[6]Functions and Application of the AP2/ERF Transcription Factor Family in Crop Improvement[J]. Zhao-Shi Xu,Ming Chen,Lian-Cheng Li and You-Zhi Ma~* National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement(NFCRI),Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture,Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agriculture Sciences(CAAS),Beijing 100081,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2011(07)
[7]植物对盐胁迫响应的信号转导途径[J]. 陈莎莎,兰海燕. 植物生理学报. 2011(02)
[8]盐胁迫下不同基因型冬小麦渗透及离子的毒害效应[J]. 徐猛,马巧荣,张继涛,王林权. 生态学报. 2011(03)
[9]渗透胁迫对植物抗氧化酶影响的研究进展[J]. 褚妍,任菲,赵贵林,胡国霞,陈强,李雪梅. 安徽农业科学. 2011(03)
[10]植物非生物逆境胁迫DREB/CBF转录因子的研究进展[J]. 李科友,朱海兰. 林业科学. 2011(01)
博士论文
[1]拟南芥chyB和DREB2A基因对转基因烟草抗逆的研究[D]. 赵清.天津大学 2013
[2]油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D]. 陈良.华中师范大学 2011
[3]棉花14-3-3蛋白在纤维发育中的功能表达和相互作用研究[D]. 张则婷.华中师范大学 2010
[4]SeNHX1耐盐分子机制与耐盐洋桔梗培育[D]. 杨小玲.天津大学 2010
硕士论文
[1]白菜蛋白磷酸酶2C基因BcABI1的分离与表达分析[D]. 胡帅.浙江大学 2012
[2]亚洲棉GaP5CS与GaTPS基因的克隆与功能鉴定[D]. 陈亚娟.中国农业科学院 2009
本文编号：3349428
【文章来源】：华中师范大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：135 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
1.1 植物抗逆的机制
1.1.1 盐和干旱胁迫对植物的危害
1.1.2 植物适应盐和干旱胁迫的生理机制
1.1.3 植物对干旱和盐胁迫的信号应答机制
1.2 植物非生物胁迫转录因子DREB/CBF的研究进展
1.2.1 植物AP2/ERF转录因子家族
1.2.2 植物DREB/CBF转录因子的结构特征
1.2.3 植物DREB/CBF转录因子基因的生物学功能
1.2.4 植物DREB/CBF转录因子基因的表达调控
1.2.5 DREB/CBF转录因子在植物抗逆工程中的应用
1.3 棉花DREB/CBF基因的研究进展
1.4 立题依据及研究意义
第二章 棉花CBF基因筛选鉴定和表达分析
2.1 实验材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 工具酶
2.1.3 常用的化学试剂
2.1.4 常用储液和缓冲液
2.1.5 MS培养基
2.1.6 PCR扩增引物及试剂
2.2 实验器材
2.3 实验方法
2.3.1 GhCBF基因的电子克隆及生物信息学分析
2.3.2 GhCBF基因的序列分析
2.3.3 棉花无菌苗的培养及材料的收取
2.3.4 棉花总RNA提取、纯化以及逆转录反应
2.3.5 实时定量RT-PCR分析
2.4 实验结果
2.4.1 GhCBF基因筛选鉴定
2.4.2 GhCBF基因的进化树分析
2.4.3 GhCBF基因的鉴定和序列分析
2.4.4 GhCBF基因在冷胁迫条件下的表达分析
2.4.5 GhCBF基因在干旱胁迫条件下的表达分析
2.4.6 GhCBF基因在盐胁迫条件下的表达分析
2.4.7 GhCBF基因在各组织中的表达分析
2.5 讨论
第三章 棉花GHCBF3基因分离鉴定和表达分析
3.1 实验材料
3.1.1 植物材料
3.1.2 菌株和载体
3.1.3 工具酶
3.1.4 常用的化学试剂和试剂盒
3.1.5 常用储液和缓冲液
3.1.6 培养基
3.1.7 棉花基因组DNA提取试剂
3.1.8 PCR扩增引物及试剂
3.1.9 DNA测序
3.2 实验器材
3.3 实验方法
3.3.1 DNA及蛋白质序列分析
3.3.2 棉花无菌苗的培养及材料的收取
3.3.3 棉花基因组DNA的提取
3.3.4 拟南芥的培养
3.3.5 棉花和拟南芥总RNA提取、纯化以及逆转录反应
3.3.6 实时定量RT-PCR分析
3.3.7 GhCBF3基因全长序列的克隆
3.3.8 GhCBF3：eGFP载体构建和亚细胞定位分析
3.3.9 GhCBF3基因启动子全长序列的克隆
3.3.10 GhCBF3基因自激活检测
3.4 实验结果
3.4.1 GhCBF3基因的分离、鉴定和序列分析
3.4.2 GhCBF3基因的进化树分析
3.4.3 GhCBF3基因在棉花各组织中的表达分析
3.4.4 GhCBF3基因受盐、干旱和ABA的诱导表达
3.4.5 GhCBF3蛋白的亚细胞定位分析
3.4.6 GhCBF3自激活分析
3.4.7 GhCBF3基因启动子受盐和干旱胁迫诱导
3.5 讨论
第四章 棉花GHCBF3基因的抗逆功能分析
4.1 实验材料
4.1.1 植物材料
4.1.2 菌株和载体
4.1.3 工具酶
4.1.4 常用的化学试剂
4.1.5 常用储液和缓冲液
4.1.6 培养基
4.1.7 PCR扩增引物、试剂
4.2 实验器材
4.3 实验方法
4.3.1 拟南芥的培养
4.3.2 GhCBF3过量表达载体的构建
4.3.3 过量表达GhCBF3基因拟南芥的转化和阳性苗PCR检测
4.3.4 过量表达GhCBF3基因拟南芥RNA水平检测表达量
4.3.5 拟南芥的非生物胁迫处理方法
4.3.6 拟南芥生理指标测定方法
4.3.7 拟南芥气孔导度测定方法
4.3.8 qRT-PCR分析ABA相关基因的表达
4.4 实验结果
4.4.1 gDNA和RNA水平检测转基因拟南芥中GhCBF3基因的表达
4.4.2 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥耐盐性分析
4.4.3 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥抗旱性
4.4.4 过量表达GhCBF3基因提高转基因拟南芥对ABA的敏感性
4.4.5 过量表达GhCBF3基因对拟南芥ABA和抗性相关基因的表达分析
4.5 讨论
第五章 棉花GHCBF2基因的克隆、鉴定和抗逆功能分析
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 菌株载体和工具酶
5.1.3 常用的化学试剂
5.1.4 常用储液、缓冲液和培养基
5.1.5 PCR扩增引物、试剂
5.2 实验方法
5.2.1 GhCBF2过量表达载体的构建
5.2.2 过量表达GhCBF2基因拟南芥的转化和阳性苗PCR检测
5.2.3 拟南芥的非生物胁迫处理方法
5.2.4 拟南芥生理指标测定方法
5.2.5 qRT-PCR分析ABA相关基因的表达
5.3 实验结果
5.3.1 GhCBF2基因的诱导表达分析
5.3.2 GhCBF2基因的克隆
5.3.3 GhCBF2基因鉴定和序列分析
5.3.4 GhCBF2进化树分析
5.3.5 GhCBF2基因的组织表达分析
5.3.6 GhCBF2蛋白亚细胞定位分析
5.3.7 过量表达GhCBF2基因拟南芥阳性苗gDNA和RNA水平检测
5.3.8 过量表达GhCBF2基因提高逆境条件下拟南芥种子萌发率
5.3.9 过量表达GhCBF2基因提高拟南芥幼苗抗逆性
5.3.10 过量表达GhCBF2基因提高拟南芥抗逆性
5.3.11 过量表达GhCBF2基因抗性生理指标测定
5.3.12 过量表达GhCBF2基因拟南芥抗逆相关基因的表达分析
5.4 讨论
结论
本论文的主要创新点
参考文献
附录
博士期间撰写和发表的学术论文
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]Improved salt tolerance of Populus davidiana × P. bolleana overexpressed LEA from Tamarix androssowii[J]. Yanshuang Sun,Su Chen,Haijiao Huang,Jing Jiang,Shuang Bai,Guifeng Liu. Journal of Forestry Research. 2014(04)
[2]DREB/CBF基因响应植物抗冷途径的研究进展[J]. 刘杰,马欣,董凤丽,周蕴薇. 林业科技. 2013(03)
[3]藜CaMAPKK2的表达分析及盐胁迫信号通路互作组分的筛选[J]. 陈莎莎,贺转转,姜生秀,李晓荣,邢佳佳,吕秀云,兰海燕. 中国农业科学. 2013(05)
[4]盐生植物耐盐分子机制的研究进展[J]. 付畅,孙玉刚,傅桂荣. 生物技术通报. 2013(01)
[5]PYR/PYL/RCAR蛋白介导植物ABA的信号转导[J]. 胡帅,王芳展,刘振宁,刘亚培,余小林. 遗传. 2012(05)
[6]Functions and Application of the AP2/ERF Transcription Factor Family in Crop Improvement[J]. Zhao-Shi Xu,Ming Chen,Lian-Cheng Li and You-Zhi Ma~* National Key Facility of Crop Gene Resources and Genetic Improvement(NFCRI),Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture,Institute of Crop Science,Chinese Academy of Agriculture Sciences(CAAS),Beijing 100081,China. Journal of Integrative Plant Biology. 2011(07)
[7]植物对盐胁迫响应的信号转导途径[J]. 陈莎莎,兰海燕. 植物生理学报. 2011(02)
[8]盐胁迫下不同基因型冬小麦渗透及离子的毒害效应[J]. 徐猛,马巧荣,张继涛,王林权. 生态学报. 2011(03)
[9]渗透胁迫对植物抗氧化酶影响的研究进展[J]. 褚妍,任菲,赵贵林,胡国霞,陈强,李雪梅. 安徽农业科学. 2011(03)
[10]植物非生物逆境胁迫DREB/CBF转录因子的研究进展[J]. 李科友,朱海兰. 林业科学. 2011(01)
博士论文
[1]拟南芥chyB和DREB2A基因对转基因烟草抗逆的研究[D]. 赵清.天津大学 2013
[2]油菜抗逆相关基因的鉴定和功能研究[D]. 陈良.华中师范大学 2011
[3]棉花14-3-3蛋白在纤维发育中的功能表达和相互作用研究[D]. 张则婷.华中师范大学 2010
[4]SeNHX1耐盐分子机制与耐盐洋桔梗培育[D]. 杨小玲.天津大学 2010
硕士论文
[1]白菜蛋白磷酸酶2C基因BcABI1的分离与表达分析[D]. 胡帅.浙江大学 2012
[2]亚洲棉GaP5CS与GaTPS基因的克隆与功能鉴定[D]. 陈亚娟.中国农业科学院 2009
本文编号：3349428
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