弱毒突变体对野生型马铃薯X病毒的交叉保护及二者侵染本氏烟的转录组学分析

发布时间：2017-04-29 22:17

  本文关键词：弱毒突变体对野生型马铃薯X病毒的交叉保护及二者侵染本氏烟的转录组学分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)属于马铃薯X病毒属(Potexvirus),主要侵染马铃薯、番茄、辣椒、烟草等茄科作物,引起严重的病害。如果PVX与马铃薯Y病毒属的病毒共同侵染,会产生协生作用,引起更为严重的症状。近年来,关于PVX基因组结构和功能、株系划分、寄主抗病机制以及防治技术等方面研究较多,但是关于PVX弱毒突变体的筛选及致病机理的研究较少。本文以自主构建的PVX侵染性克隆为基础,利用定点突变的方法获得突变体,然后从中筛选弱毒突变体,测定了其交叉保护效果;同时利用转录组测序技术分析野生型PVX和一个弱毒突变体侵染本氏烟后的基因表达差异;对弱毒突变体进行改造防治其他多种病毒。主要结果如下:利用反向遗传学证明依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)上四个氨基酸位点的突变都可以降低PVX的致病力。当把PVX RdRp第46位的Glu(E46)、第863位的Asn(N863)、第968位的Asn(N968)、第1001位的Glu(E1001)分别突变为Ala时都能减轻PVX在本氏烟上的症状。Western blotting和Northern blotting检测结果表明,四个突变体在寄主体内的浓度、正链和负链RNA的积累水平较野生型均明显降低。测定了四个弱毒突变体对野生型PVX的交叉保护效果,研究了交叉保护作用机理。保护间隔期为5天时,四个突变体都没有保护效果。当保护间隔期为10天时,突变体E1001A具有较好的交叉保护效果,保护效率为100%;E46A能延迟发病;N863A和N968A没有保护效果。间隔期为15天时,E1001A具有较好的保护效果,保护效率为100%;E46A具有不完全的保护效果,保护效率为33.3%;N863A和N968A依然没有明显的保护效果。将E46和E1001同时突变为Ala,得到双位点突变体dM,在间隔期为15天时,dM对PVX的保护效率为23.3%。利用Northern blotting检测了弱毒突变体的siRNA积累水平,证明弱毒突变体的siRNA积累水平与之介导的抗性水平呈正相关,推测PVX弱毒突变体介导的交叉保护作用机制可能是由siRNA介导的。但是弱毒突变体也能表达衣壳蛋白(CP),因此不能完全排除CP在交叉保护中的作用。利用数字基因表达谱测序技术(DGE)分析了野生型PVX(Pwt)和弱毒突变体(Pat)侵染本氏烟后引发的基因表达差异。接种后第1天,Pwt使467个基因表达水平发生变化,GO分析显示这些基因在DNA代谢过程、DNA复制、叶绿素生物合成过程、叶绿素代谢过程、色素生物合成过程、色素代谢过程、Mg螯合酶活性等几个类别中呈现显著的富集,KEGG分析显示DNA复制为显著富集的代谢通路。接种后第2天,Pwt使1160个基因表达水平发生变化,这些基因主要富集于光合作用、光合膜、类囊体、类囊体部分、光系统I和光系统II几个类别中,显著富集于光合作用-天线蛋白、光合作用和类胡萝卜素生物合成几个代谢通路。接种后第10天,Pwt使1693个基因表达发生变化,这些基因在生物过程分类中的生物过程、代谢过程、细胞过程、有机物质代谢过程、初级代谢过程、细胞代谢过程、大分子代谢过程和细胞大分子代谢过程等类别中呈现最显著的富集,KEGG分析显示最显著富集的途径为核糖体。推测Pwt侵染可能首先利用了寄主的DNA复制和代谢系统完成自身的复制和增殖,同时也影响了光合色素相关的基因表达,使光合作用受到影响,从而使生物过程、代谢过程、细胞过程等过程发生了变化,最终导致症状的形成。对数据进一步分析发现,Pwt系统侵染后大多数与叶绿素代谢相关的基因、类胡萝卜素合成相关的基因都发生了显著的上调,大部分与纤维素合成相关的基因以及与细胞壁结构相关的基因都发生了下调,这些基因的变化可能是Pwt侵染引起花叶、皱缩症状的主要原因之一。此外,Pwt在侵染初期可能通过抑制水杨酸、茉莉酸信号转导途径从而打破了寄主抗性,在侵染后期使许多与泛素化系统相关的基因的表达都发生了显著的变化,推测这些基因的变化使泛素化参与调控的植物生理反应受到影响,也可能是Pwt侵染引起严重症状的原因之一。通过对PVX弱毒突变体进行改造获得了兼抗烟草花叶病毒(TMV)和马铃薯Y病毒(PVY)的弱毒疫苗。在TMV和PVY的基因组中各筛选几个片段,分别克隆到弱毒突变体E1001A中进行交叉保护效果测定,发现TMV RdRp-2和PVY-7两个片段分别能诱导对TMV和PVY较好的抗性。将筛选到的两个最佳片段通过融合PCR聚合后重新连入PVX弱毒突变体E1001A中,得到二联弱毒疫苗。温室测定二联疫苗对TMV和PVY介导的交叉保护效果,发现二联弱毒疫苗对两种病毒都表现出一定的抗性,对TMV的保护效率为33.3%,而对PVY的保护效率为44.4%。
【关键词】：马铃薯X病毒 定点突变 弱毒突变体 交叉保护 转录组 差异表达基因 弱毒疫苗
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S432.41
【目录】：

• 中文摘要10-12
• Abstract12-15
• 1 引言15-29
• 1.1 交叉保护作用类型16-18
• 1.2 交叉保护作用机制18-20
• 1.2.1 衣壳蛋白介导的交叉保护作用18
• 1.2.2 RNA介导的交叉保护作用18-20
• 1.3 影响交叉保护作用的因素20-21
• 1.3.1 株系专化性20
• 1.3.2 温度20
• 1.3.3 寄主因素20
• 1.3.4 保护间隔期20-21
• 1.3.5 挑战病毒的接种量21
• 1.3.6 挑战病毒的形式21
• 1.4 限制交叉保护应用的因素及解决措施21-22
• 1.5 马铃薯X病毒的研究现状22-25
• 1.5.1 危害22
• 1.5.2 基因组的结构与功能22-23
• 1.5.3 复制和表达23-24
• 1.5.4 株系划分24-25
• 1.5.5 马铃薯X病毒与马铃薯Y病毒属病毒的协生作用25
• 1.6 转录组学在病毒与寄主植物互作研究中的应用25-28
• 1.6.1 转录组学的研究方法26-28
• 1.6.2 转录组学在植物病毒研究中的应用28
• 1.7 本研究的目的意义28-29
• 2 材料与方法29-63
• 2.1 材料29
• 2.1.1 毒源的保存29
• 2.1.2 供试植物29
• 2.1.3 菌株29
• 2.1.4 血清29
• 2.1.5 酶与各种生化试剂29
• 2.1.6 寡聚核苷酸引物29
• 2.2 方法29-63
• 2.2.1 定点突变29-36
• 2.2.2 病毒接种36-38
• 2.2.3 RT-PCR检测38-39
• 2.2.4 Western blotting检测39-42
• 2.2.5 实时荧光定量PCR检测42-45
• 2.2.6 Northern blotting检测45-49
• 2.2.7 交叉保护效果测定49-50
• 2.2.8 siRNA积累水平的测定50-52
• 2.2.9 挑战接种后强毒总RNA和siRNA积累水平的测定52-54
• 2.2.10 本氏烟的转录组数据分析54-58
• 2.2.11 单联弱毒疫苗的研制58-61
• 2.2.12 二联弱毒疫苗的研制61-63
• 3 结果与分析63-105
• 3.1 PVX侵染性克隆的构建63-64
• 3.2 PVX弱毒突变体的筛选及交叉保护效果64-79
• 3.2.1 突变质粒的获得64
• 3.2.2 突变体在本氏烟上的症状64-66
• 3.2.3 突变体对病毒积累水平的影响66
• 3.2.4 突变体对病毒RNA积累水平的影响66-67
• 3.2.5 突变体对病毒正链和负链RNA积累水平的影响67-68
• 3.2.6 弱毒突变体介导的交叉保护作用68-73
• 3.2.7 双位点突变体在本氏烟上的症状73-74
• 3.2.8 双位点突变体在本氏烟上介导的交叉保护效果74
• 3.2.9 弱毒突变体siRNA的积累量与其抗性水平的关系74-76
• 3.2.10 突变体E1001A的稳定性76
• 3.2.11 突变体E1001A在普通烟上的症状及介导的交叉保护效果76-78
• 3.2.12 突变体E1001A在番茄上介导的交叉保护效果78-79
• 3.3 本氏烟的转录组数据分析79-100
• 3.3.1 RNA的质量检测79
• 3.3.2 转录组数据分析79-100
• 3.4 单联弱毒疫苗的交叉保护效果100-103
• 3.4.1 单联弱毒疫苗的构建100-101
• 3.4.2 单联弱毒疫苗介导的交叉保护效果101-103
• 3.5 二联弱毒疫苗的交叉保护效果103-105
• 3.5.1 二联弱毒疫苗的构建103
• 3.5.2 二联弱毒疫苗介导的交叉保护效果103-105
• 4 讨论105-112
• 4.1 RdRp不同位点的突变影响病毒致病力的机制105
• 4.2 RNA沉默抑制子与病毒致病力的关系105-106
• 4.3 病毒产生的症状严重程度与病毒积累量的关系106
• 4.4 弱毒突变体的交叉保护作用106-107
• 4.5 Pwt和Pat侵染的本氏烟的转录组数据分析107-110
• 4.6 二联弱毒疫苗在防治病毒病上的应用110-112
• 5 结论112-113
• 参考文献113-128
• 致谢128-129
• 攻读博士期间发表论文情况129

【共引文献】

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1 徐雷;姜波;;病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)在豌豆基因功能研究中的应用[J];安徽农业科学;2013年29期

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3 杨玛丽;彭宏;陈天子;张保龙;赵统敏;余文贵;赵丽萍;;RNAi介导的转基因番茄抗TYLCV研究[J];西南农业学报;2014年06期

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2 张晓峰;芜菁邹缩病毒复制酶小亚基P28在重复侵染排斥中的功能研究[D];中国农业大学;2013年

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7 吴根土;两种植物病毒编码的RNA沉默抑制子在寄主体内的功能研究[D];浙江大学;2014年

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本文编号：335713