诱导子调控红松细胞合成松多酚机制的研究

发布时间：2017-05-01 00:08

  本文关键词：诱导子调控红松细胞合成松多酚机制的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：多酚是红松中具有重要生理功能的次生代谢产物,可以提高机体抗氧化能力,有助于预防癌症和心脑血管疾病的发生,在营养、健康、医药领域的关注度逐渐提高。因此研究红松多酚合成代谢途径及其调控手段具有重要的意义。本研究以组织培养红松胚诱导生成的不定芽为实验材料,以8种诱导子(PHE、CA、MeJA、SA、CTS、YE、La、 Eu)为研究对象,以多酚和原花青素含量为指标,进行诱导子的筛选工作,确立促进红松多酚合成最佳的诱导子以及最佳的诱导处理组合条件,进一步分析诱导子对红松氧化应激防御系统的影响；采用Illumina HiSeq技术对红松进行转录组测序,挖掘与多酚生物合成相关功能基因,分析红松多酚的合成代谢途径；采用RT-PCR技术分析诱导子对红松多酚合成相关功能基因的表达影响,探究诱导子调控多酚合成的作用机制。主要的研究结果如下：在供试浓度范围内,不同的诱导子对红松不定芽的生长具有不同的生理作用,PHE、CTS、YE、La和Eu在合适的浓度范围内可以显著促进生长；CA、MeJA和SA明显抑制生长；高浓度的PHE、CTS也会抑制生长。7种诱导子(PHE、MeJA、SA、 CTS、YE、La、Eu)在合适的浓度范围内可以显著提高多酚和原花青素的积累量,促进多酚物质的合成,最佳的诱导浓度分别为2mmol/L PHE、10μmol/L MeJA、40μmol/L SA、100mg/LCTS、100mg/L YE、100μmol/L La和400μmol/L Eu。Plackett-Burman实验结果显示,7种诱导子因素影响多酚积累量的显著性大小依次为：CTSLaMeJAPHEEuS AYE,确定影响多酚积累量的3种关键因素为：CTS、 La、MeJA。通过对CTS+La+MeJA组合诱导条件进行Box-Benhnken Design响应面优化实验,优化得到的最佳诱导条件为：CTS 79.58mg/L、La 42.21μmol/L、MeJA 16.63 μmol/L,预测多酚积累量最高可达到14.28mg/g FW,实际多酚积累量为13.42 mg/g FW,与对照组相比提高了122.19%。3种诱导子CTS、La、MeJA促进多酚合成具有协同增效作用。3种诱导子MeJA、CTS、La以及CTS+ La+MeJA组合可以显著激活红松抗氧化防御反应和苯丙烷代谢途径,促进多酚物质合成与积累,诱导响应时间和强度具有差异性。CTS+ La+MeJA组合诱导效果显著优于3种诱导子单独使用,利用3种诱导子之间的协同作用,可以缓解MeJA对红松不定芽生长的抑制作用；更大程度提高红松氧化应激防御系统抗氧化酶(SOD、POD、CAT、PAL、C4H)的活性和增加抗氧化物质(多酚、原花青素)的积累量。CTS+ La+MeJA作为外源诱导子通过信号转导系统将诱导信号传递到细胞内,迅速刺激红松不定芽的氧化应激防御系统,苯丙烷代谢途径被活化,促进了抗氧化物质多酚的合成与积累。通过Illumina HiSeq技术对红松不定芽进行了转录组测序分析,获得了13369359条contig,172608条unigene。将获得的unigene与NR、GO、KOG和KEGG基因数据库进行比对和功能预测。其中58406(33.84%)条unigenes得到了功能注释；17996条unigene归纳到GO数据库的48个聚类中；26026条unigene被注释到KOG数据库的25个功能类别；9846条unigene归入KEGG数据库的334条生物学通路中；997条unigene参与了次生代谢生物合成。通过功能注释发现有49条unigene参与了红松多酚的生物合成,涉及了5条次生代谢生物合成途径(苯丙烷生物合成途径、类黄酮生物合成途径、黄酮和黄酮醇生物合成途径、花青素生物合成途径、二苯乙烯生物合成途径)和14个相关功能基因(PAL、C4H、4CL、CHS、F3H、F3'H、FLS、DFR、ANR、 LAR、UFGT、3-OMT、CCoAOMT、HCT)。CTS+La+MeJA处理组和对照组两个红松转录样本进行差异表达分析,筛选出5713条差异表达unigene,其中3449条unigene为表达上调,2264条unigene为表达下调,主要参与核糖体途径、生化代谢途径和次生代谢物的生物合成途径。在差异表达文库中筛选出与多酚合成相关的23条表达上调unigene编码多酚合成途径中8个功能基因(PAL、4CL、CHS、F3H、DFR、ANR、LAR和UFGT)。将这8个功能基因进行RT-PCR验证和表达分析,诱导子(CTS、MeJA、La、CTS+La+MeJA)均可诱导8种功能基因显著表达,其中转录水平变化最大的为CHS,其次为ANR和LAR。初步证实CHS、 ANR、LAR为红松多酚合成的关键功能基因。CTS+La+MeJA组合诱导红松细胞CHS、ANR、LAR的上调表达最为显著,分别是对照组的185、25、21倍。CTS+La+MeJA诱导提高总酚和总原花青素含量的同时,还可以显著提高儿茶素、表儿茶素、原花青定B2和花旗松素4种单体酚的含量。CTS+La+MeJA诱导多酚合成关键酶基因CHS、ANR、LAR的高表达与多酚组分含量的增加具有正相关性。CTS+La+MeJA与红松细胞相互作用,能够快速激活细胞氧化应激防御系统,高度专一和选择性地诱导红松多酚生物合成关键功能基因(CHS、ANR、LAR)的表达,最终促进目标次生代谢产物多酚的合成和积累,从而达到调控多酚合成的目的。
【关键词】：红松多酚 诱导子 氧化应激防御系统 基因表达 多酚合成代谢途径
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S791.247
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 绪论14-27
• 1.1 植物多酚的研究进展14-18
• 1.1.1 多酚的结构与分类14-15
• 1.1.2 松多酚的结构和功能特性15-16
• 1.1.3 多酚的生物合成途径16-18
• 1.2 植物次生代谢合成调控的研究18-25
• 1.2.1 诱导子对植物次生代谢合成的调控作用20-22
• 1.2.2 诱导子促进次生代谢合成的作用机制22-25
• 1.3 研究的目的和意义25-26
• 1.4 研究的主要内容26-27
• 2 促进红松多酚合成诱导子的筛选27-39
• 2.1 实验材料与方法27-28
• 2.1.1 实验材料27
• 2.1.2 红松不定芽的培养27
• 2.1.3 诱导子处理27-28
• 2.1.4 多酚提取方法28
• 2.1.5 多酚含量测定方法28
• 2.1.6 原花青素含量测定方法28
• 2.1.7 数据处理28
• 2.2 结果及分析28-38
• 2.2.1 前体物质(PHE、CA)对红松多酚合成的影响28-30
• 2.2.2 植物激素(MeJA、SA)对红松多酚合成的影响30-33
• 2.2.3 生物诱导子(CTS、YE)对红松多酚合成的影响33-35
• 2.2.4 稀土元素(La、Eu)对红松多酚合成的影响35-37
• 2.2.5 诱导子对松多酚合成诱导效果的对比分析37-38
• 2.3 本章小结38-39
• 3 Plackett-Burman和Box-Benhnken Design设计优化促进红松多酚合成诱导条件的研究39-47
• 3.1 实验材料与方法39-40
• 3.1.1 实验材料39
• 3.1.2 Plackett-Barman实验设计39
• 3.1.3 最陡爬坡实验设计39-40
• 3.1.4 响应面实验设计40
• 3.1.5 数据处理40
• 3.2 结果与分析40-46
• 3.2.1 Plackett-Barman实验设计确定关键影响因素40-41
• 3.2.2 最陡爬坡试验研究最大响应值的响应区域41-42
• 3.2.3 响应面优化试验结果分析42-44
• 3.2.4 诱导效果的对比44-46
• 3.3 本章小结46-47
• 4 诱导子对红松氧化应激防御系统的影响47-54
• 4.1 实验材料与方法47-48
• 4.1.1 实验材料47
• 4.1.2 氧化应激防御系统相关酶的提取方法47
• 4.1.3 氧化应激防御系统相关酶活测定方法47-48
• 4.1.4 数据处理48
• 4.2 结果与分析48-53
• 4.2.1 诱导子对红松不定芽生长的影响48-49
• 4.2.2 诱导子对抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性的影响49-50
• 4.2.3 诱导子对PAL和C4H活性的影响50-52
• 4.2.4 诱导子对多酚和原花青素积累量的影响52-53
• 4.3 本章小结53-54
• 5 红松转录组构建和Illumina HiSeq 2500测序54-69
• 5.1 实验材料与方法54-56
• 5.1.1 实验材料54
• 5.1.2 测序文库的构建54-55
• 5.1.3 生物信息分析55-56
• 5.1.4 Unigene功能注释56
• 5.2 结果与分析56-68
• 5.2.1 转录组数据库的组装56-58
• 5.2.2 Unigene功能注释58
• 5.2.3 GO数据库注释分析58-61
• 5.2.4 KOG数据库注释分析61-63
• 5.2.5 Unigene KEGG Pathway注释分析63-68
• 5.3 本章小结68-69
• 6 诱导子调控红松多酚合成基因表达及作用机制分析69-84
• 6.1 实验材料与方法69-72
• 6.1.1 实验材料69
• 6.1.2 差异表达量计算69-70
• 6.1.3 RT-PCR分析多酚合成结构基因表达70-72
• 6.1.4 HPLC法测定多酚组分含量72
• 6.2 结果与分析72-83
• 6.2.1 Unigene的差异表达分析72-73
• 6.2.2 差异表达基因GO显著富集分析73-75
• 6.2.3 差异表达基因Pathway显著富集分析75-79
• 6.2.4 诱导子对多酚合成相关基因表达的影响79-80
• 6.2.5 CTS+La+MeJA对红松多酚合成的调控作用80-83
• 6.3 本章小结83-84
• 结论84-86
• 参考文献86-101
• 附录101-102
• 攻读学位期间发表的学术论文102-103
• 致谢103-104

【参考文献】

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