对比研究狂犬病病毒BD06及SRV9株对宿主细胞干扰素通路的影响

发布时间：2017-05-01 21:08

  本文关键词：对比研究狂犬病病毒BD06及SRV9株对宿主细胞干扰素通路的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：狂犬病至今依然是一种严重的公共健康威胁,尤其是在发展中国家和地区。我国每年因狂犬病死亡的人数超过2000,然而狂犬病的发病机制至今依然不清楚,也缺乏有效的治疗手段,使得其病死率接近100%。狂犬病的病原主要是狂犬病病毒(RABV),RABV病毒粒子由5种结构蛋白(核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和大蛋白)及负链基因组RNA组成。为了弄清RABV的致病机制,近年来学者们一直致力于研究RABV病毒粒子各组分与宿主各种生物学过程之间的相互作用,如RABV结构蛋白对宿主固有免疫的影响等,希望能借类似的研究找到治疗狂犬病的手段。可喜的是,最近对RABV的研究取得了很大的进展,比如科学家发现RABV磷蛋白可以抑制宿主的干扰素通路,通过改变磷蛋白的这种能力可以影响病毒的毒力;又比如日本科学家发现RABV核蛋白也可以影响干扰素的激活,通过改变核蛋白的氨基酸组成可以减弱病毒的毒力。然而,依然有很多问题需要我们去解决,例如RABV的干扰素抑制能力与病毒毒力是否存在某种必然联系;RABV磷蛋白及核蛋白均可以影响干扰素的激活,那么其它蛋白是否也具有这种能力;RABV对干扰素的抑制能力在病毒感染过程中扮演一个什么角色,这些问题都还不清楚。鉴于此,我们设计实验开展了本课题。我们选择了一株在世界范围内大规模应用于疫苗生产的RABV弱毒株SRV9和一株在中国广泛流行的强毒株BD06,利用对比研究的方法分析了它们在体内以及体外感染造成的基因表达差异,同时分析了两株病毒结构蛋白的干扰素拮抗能力,以弄清两株病毒结构蛋白干扰素拮抗能力与病毒毒力之间的关系。具体研究过程如下:我们首先筛选条件获取了在细胞上培养的较高滴度的BD06,并对其进行了鉴定,确定没有发生关键性突变,且毒力没有减弱;然后我们利用脑内攻毒的方法,将相同毒量104ffu(30μl)的强毒BD06和弱毒SRV9以及培养基对照接种Balb/c小鼠,观察两株病毒感染的过程,结果发现SRV9完全不致病,只是在感染的初期造成了感染病毒小鼠体重的下降,而感染BD06的小鼠在第5天全部发病,并在第6天到第7天全部死亡;鉴于两种病毒完全不一致的感染结果,而小鼠大脑对病毒的抵抗尤其是早期主要依赖于固有免疫,对RABV来说,宿主的固有免疫主要以干扰素相关反应为核心,因此我们分析了小鼠感染两株RABV的干扰素反应。分别将感染两株病毒后第2天、第4天和第6天的小鼠取脑组织提取RNA,利用定量PCR的方法分析了干扰素β(IFNβ)及其诱导的抗病毒反应相关蛋白OAS-1G和Mx1的表达。结果发现SRV9在感染后第2天即可激活较高水平的干扰素反应,并在第4天达到峰值,而在第6天出现明显的回落;但是BD06感染的小鼠在第2天表现出一个相对较弱的干扰素反应,在第4天明显升高,而在第6天小鼠发病濒死时仍持续升高。二者的干扰素反应动力学差别很大,BD06感染诱导的干扰素反应早期较弱而晚期较强与SRV9构成显著差别。我们接下来对比了两株RABV感染293细胞后,细胞基因表达谱的变化。利用Ion proton平台对RABV感染的293AD细胞转录组进行测序。每个样品共获得了约1200万个reads,比对到参考基因和参考基因组之后,都能够获得大于80%的比对率,说明测序结果可靠。对所有读数比对到参考基因后利用RPKM对基因的表达进行了归一化,并对BD06和SRV9相对于对照以及BD06相对于SRV9的基因表达变化进行了定量分析,分别找到了2317(SRV9相对于对照),3331(BD06相对于对照)和2760(BD06相对于SRV9)个差异表达的基因。对这些差异表达的基因进行聚类分析,发现根据GO分类进行的聚类中,SRV9及BD06相对于对照发生改变的基因并没有明显的底层条目聚集,而当我们将BD06对SRV9的表达差异进行聚类分析时,发现差异表达的基因在细胞因子这一条目聚集。对差异表达的基因基于KEGG注释做了通路分析,结果发现BD06造成的表达差异向病毒感染相关通路聚集,而SRV9的感染的差异基因富集不明显。说明在感染的早期,BD06与细胞的相互作用相对于SRV9更加激烈。考虑到RABV结构蛋白对固有免疫有拮抗作用,我们接着分别对比了BD06及SRV9对干扰素通路抑制能力的差别。利用RIG-I蛋白N端的CARDs结构域可以激活类似于RABV激活的固有免疫反应,所以为了排除非相关成分对实验结果的干扰,我们没有选择用RABV或者诸如VSV之类的病毒来激活细胞的固有免疫,而是选择直接转染表达人RIG-I-CARDs的真核载体以激活细胞的固有免疫,主要是RIG-I依赖的IFNβ相关通路。然后我们分别转染表达载体对照及SRV9或BD06核蛋白、磷蛋白、基质蛋白或糖蛋白的真核质粒,在细胞同时过表达RIG-I-CARDs以及RABV结构蛋白,用免疫印迹检测这些基因在细胞中的过表达后,用定量PCR的方法检测细胞的干扰素反应,包括检测IFNβ以及IFNβ诱导基因PKR和OAS的表达水平以对比分析RABV结构蛋白对干扰素激活的抑制能力。结果发现RABV磷蛋白表现出主要的对IFNβ激活的抑制能力,且磷蛋白的对干扰素通路的抑制能力要在SRV9和BD06之间存在显著差异。尽管有报道表明RABV核蛋白对干扰素通路激活也存在抑制能力,但是我们表达核蛋白时,发现核蛋白对RIG-I激活的抑制作用不显著。另外尽管与RABV类似的弹状病毒VSV基质蛋白对干扰素激活有抑制能力,但是RABV的基质蛋白并没有表现出这种能力,同时糖蛋白也不能拮抗干扰素的激活过程。由以上研究,可以得出结论如下:狂犬病病毒弱毒SRV9株能在感染小鼠大脑后迅速诱导固有免疫反应,并在感染中期达到峰值,但是会在感染后期回落;而强毒株BD06株则在感染早期产生相对较弱的干扰素反应,但是会随着感染持续加强。两株病毒的干扰素反应动力学存在显著差异,且单纯的干扰素反应并不足以清除病毒,保护动物免受死亡。狂犬病病毒弱毒株SRV9株诱导细胞基因表达的变化是普遍的,但是富集程度不高,BD06相对于SRV9发生的基因表达变化在功能上向细胞因子这一分类富集,在通路上向抗病毒反应相关通路富集。BD06在感染诱导更明显的固有免疫反应。狂犬病病毒磷蛋白表现出主要的干扰素拮抗活性,核蛋白对干扰素通路的影响是间接的,而糖蛋白基质蛋白不具备这种能力。BD06株磷蛋白的干扰素拮抗能力弱于SRV9磷蛋白,而两株病毒核蛋白的干扰素通路抑制能力无差别。强毒BD06株狂犬病病毒对干扰素激活的抑制能力弱于SRV9株。狂犬病病毒结构蛋白对干扰素的拮抗能力与病毒毒力之间缺乏正相关性。
【关键词】：狂犬病病毒 结构蛋白 毒力 固有免疫 干扰素拮抗
【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S852.655
【目录】：

• 缩略词表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 第一章 RABV感染引起的小鼠脑内固有免疫反应对比研究14-27
• 1.1 材料与方法14-18
• 1.2 实验结果18-24
• 1.2.1 两株病毒在BHK-21细胞上的最高稳定滴度18-19
• 1.2.2 两株病毒在Balb/c上小鼠的毒力对比19-20
• 1.2.3 两株病毒引起的小鼠干扰素相关反应动力学对比20-24
• 1.3 讨论24-26
• 1.4 小结26-27
• 第二章 两株病毒感染 293AD细胞的表达谱对比分析27-41
• 2.1 实验方法27-30
• 2.2 差异表达基因的基因功能聚类分析30-33
• 2.3 差异表达基因的通路分析33-39
• 2.4 讨论39-40
• 2.5 小结40-41
• 第三章 两株病毒结构蛋白对IFNΒ 通路的拮抗能力对比分析41-52
• 3.1 材料与方法41-46
• 3.2 结果46-50
• 3.2.1 质粒构建与鉴定46
• 3.2.2 两株RABV磷蛋白对干扰素通路的影响46-47
• 3.2.3 两株RABV核蛋白对干扰素通路的影响47-48
• 3.2.4 两株RABV基质蛋白对干扰素通路的影响48-49
• 3.2.5 两株RABV糖蛋白对干扰素通路的影响49-50
• 3.3 讨论50-51
• 3.4 小结51-52
• 结论52
• 创新点52-53
• 参考文献53-57
• 文献综述57-84
• 参考文献75-84
• 个人简介84-85
• 致谢8

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 郑四清;吴增红;;浅谈狂犬病及其防控中存在的问题与解决方案[J];湖南畜牧兽医;2007年04期

2 韩改会;李回;孟先明;罗廷荣;;狂犬病病毒L蛋白的研究进展[J];广西畜牧兽医;2010年02期

3 杨毅昌,皮振举,岳洪亮,赵晓静,宋金东,李树军,唐志成,李树春;狂犬病传播途径[J];中国兽医杂志;2001年02期

4 苏经力,哈斯巴图,苏勇,布仁共格,雷子平,张有辉;羊狂犬病[J];中国兽医杂志;2001年09期

5 秦翠丽,李松彪,李治力,张许科;狂犬病基因工程苗研究进展[J];河南畜牧兽医;2001年06期

6 张海,金昌德,李六金,施新猷,娄清林,李秦;狂犬病病毒3aG株糖蛋白重组质粒构建及其体液免疫的研究[J];中国兽医科技;2002年03期

7 李有业;控制狂犬病的新举措[J];当代畜牧;2003年03期

8 孙泉云,潘水春;狂犬病的流行病学及其诊断[J];上海畜牧兽医通讯;2004年04期

9 冯洪钱;人兽共患狂犬病古今考[J];农业考古;2004年03期

10 姜海龙;钱爱东;;狂犬病病毒糖/核融合基因原核表达克隆质粒的构建与分析[J];吉林农业大学学报;2005年06期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 唐青;;中国狂犬病和狂犬病毒监测[A];第3届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2011年

2 郑文成;张朝阳;范仲鑫;邱立新;刘道新;李文平;;湖南部分地区犬狂犬病病毒的监测研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会第七届全国会员代表大会暨第十三次学术研讨会论文集（下册）[C];2009年

3 张永振;;中国狂犬病的流行病学特征及防制建议[A];全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2006年

4 夏咸柱;;加强动物狂犬病防控研究 从源头上防控人类狂犬病[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

5 张海林;;云南省狂犬病流行特征及分子流行病学研究[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

6 王传林;袁佳奇;张晓威;;狂犬病的治疗[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

7 黎天德;;中国狂犬病细胞介导免疫研究进展[A];2010全国狂犬病防控高层论坛论文集[C];2010年

8 姚利蕊;;狂犬病的传播根源及预防[A];河南省手术室护理学术会议暨围手术期安全护理高级研修班论文集[C];2009年

9 尹伟力;王雯;方绍庆;许红岩;刘宁;;蝙蝠狂犬病流行现状及其防控措施[A];动物检疫学分会2010年学术年会论文集[C];2010年

10 王晓虎;丁壮;扈荣良;;治疗性狂犬病病毒单克隆抗体的研究进展[A];中国畜牧兽医学会兽医公共卫生学分会第二次学术研讨会论文集[C];2010年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 戴欣 郭阳虎;狂犬病“跨界” 防被咬仍是关键[N];科技日报;2013年

2 褚菊仁;防治狂犬病从重点入手[N];健康报;2004年

3 ;中国狂犬病出现第3次高峰[N];北京日报;2006年

4 杜龙;慎防奶牛狂犬病[N];瓜果蔬菜报.农业信息周刊;2007年

5 本报记者　 邵文杰;全面加强狂犬病防控[N];光明日报;2006年

6 姚t，

本文编号：339648