侵染玉米的水稻黑条矮缩病毒遗传变异及其致病途径解析

发布时间：2017-05-02 08:08

  本文关键词：侵染玉米的水稻黑条矮缩病毒遗传变异及其致病途径解析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease,MRDD)是世界性的玉米病毒病害之一,在我国黄淮海夏玉米区发生尤为严重,主要病原为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV),由灰飞虱(Laodelphax striatellus,SBPH)介导以持久性传播。解析我国玉米粗缩病病原RBSDV遗传变异,及其在玉米中的致病途径是玉米粗缩病抗性机理研究和抗病育种的重要内容。本文采集我国玉米粗缩病高发区的玉米和水稻病株,通过病毒基因组测序,分析了病毒的遗传变异与进化;通过研究RBSDV侵染后玉米转录组、mi RNA-靶基因的差异,解析可能的致病途径,为玉米粗缩病抗性机理研究和抗病育种提供基础。具体研究结果如下:1.分析来自2012-2014年9个地点玉米和水稻病株的RBSDV基因组区段S1-S10遗传变异。(1)仅基因组区段S8存在9bp的缺失,其它区段均无插入或缺失突变;两个碱基间突变占变异总数的93.73%-96.11%,转换(transition,76.87%-85.92%)大于颠换(transversion,8.69%-17.43%),其中嘧啶(U/C)间转换最多,占47.72%-59.60%;核苷酸多样性最高的S9(π=0.0626)极显著(P0.01)高于最低的S4(π=0.0225);来自山东济南点的RBSDV基因组区段S9(π=0.0755)和S7(π=0.0391)核苷酸多样性最高,而江苏省南京和盐城的S9(π=0.0391)和S7(π=0.0090)区段核苷酸多样性最低,差异达到极显著水平(P0.01);玉米和水稻寄主间RBSDV基因组区段核苷酸多样性差异不显著(P0.05);2013年分离株S7序列核苷酸多样性(π=0.0307)显著高于2014年(π=0.0244)(P=0.0226)。(2)在S9和S7中分别检测到3个和1个重组事件,重组事件发生在不同寄主和地点间。采用46个非重组的RBSDV分离物S9序列与23个Gen Bank数据库中的S9序列构建系统发育树。基于S9系统发育分析表明中国玉米粗缩病株的病毒分离物遗传距离与RBSDV较近,与其它病毒(例如MRDV、MRCV或SRBSDV)遗传距离较远;基于S9和S7序列多样性均将RBSDV划分为两个类群,S7群进一步划分为两个亚群,分群与寄主和年份无关。(3)在氨基酸水平,P5-2变异最大(平均每10个氨基酸存在一个变异),P2变异最小(平均每45个氨基酸存在一个变异),同一基因组区段不同阅读框(ORF)编码蛋白的氨基酸变异不一致。(4)预测RBSDV S1-S10基因组区段的保守区,针对每个序列的保守区域设计并构建了针对不同靶位的RNAi载体。2.采用49个S9序列和111个S7序列分析RBSDV的选择响应。S7(含有两个ORF,分别表示为S7-1和S7-2)序列A+U含量丰富,且密码子多以A-(A3s,S7-1:32.64%,S7-2:29.95%)或U-结尾(U3s,S7-1:44.18%,S7-2:46.06%);S7密码子偏性程度低(Nc,S7-1:45.63;S7-2:39.96),突变是RBSDV-S7密码子偏性的主要原因,且密码子偏性与年份、寄主及地点无关;在S7-1和S7-2中共检测到12个最优密码子。S9(含有两个ORF,分别表示为S9-1和S9-2)与S7的ORF均承受负向选择或纯化作用(Ka/Ks ratios:0.0179-0.0589);同一基因组区段不同ORF选择压力水平不同,S9-2承受的选择压力显著高于S9-1(P0.01),S7-1承受的选择压力显著高于S7-2(P0.01);同一ORF在年份间、寄主间和地点间承受的选择压力差异不显著。RBSDV群体呈显著扩增趋势,在寄主、年份和部分地点间存在频繁的遗传交流。3.采用组织超薄切片方法观察玉米受RBSDV侵染后细胞组织形态变化,发现病毒主要存在于细胞质和叶绿体中,病毒侵染后玉米韧皮部、细胞壁、叶绿体等均有明显变化。利用RNA-seq技术对RBSDV侵染后的玉米转录组进行测序,显示发病相关、细胞壁相关、赤霉素相关、韧皮部相关、叶绿素相关和泛素相关基因表达量均存在显著差异。鉴定出17个玉米mi RNA家族中31个响应RBSDV的mi RNA成员,表达量差异均在2倍以上,其中17个呈上调表达,14个呈下调表达。采用降解组测序方法鉴定靶基因,发现靶基因主要富集的细胞组件是细胞核和核糖体,主要功能是与转录调节、DNA模板和DNA结合有关,其次与金属离子结合、水解酶活性、酸酐和磷等以及压力响应和光合作用有关;靶基因多参与光合作用等新陈代谢途径。转录组和mi RNA-靶基因差异表达分析显示,GRMZM2G069316和GRMZM2G031169基因参与玉米响应RBSDV的调控网络。
【关键词】：玉米粗缩病 水稻黑条矮缩病毒 遗传变异 转录组测序 致病途径
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.131.4
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-15
• 英文缩略表15-17
• 第一章 引言17-28
• 1.1 玉米粗缩病与水稻黑条矮缩病毒17-19
• 1.1.1 玉米粗缩病17-18
• 1.1.2 水稻黑条矮缩病毒及其基因组18-19
• 1.2 RNA干扰技术在植物抗病毒病育种中的应用19-20
• 1.2.1 基因工程在植物抗病毒病中的应用19
• 1.2.2 RNAi技术19
• 1.2.3 RNAi在抗病毒基因工程中的应用19-20
• 1.3 植物RNA病毒分子遗传变异及进化20-23
• 1.3.1 植物RNA病毒分子遗传变异20-21
• 1.3.2 植物病毒密码子21-22
• 1.3.3 植物RNA病毒群体遗传结构分析22-23
• 1.4 高通量测序在植物病毒病研究中的应用23-26
• 1.4.1 转录组学在植物病毒病研究中的应用23-25
• 1.4.2 mi RNA在植物病毒病研究中的应用25-26
• 1.5 本文的研究目的和意义26-27
• 1.6 技术路线图27-28
• 第二章 水稻黑条矮缩病毒基因组多样性分析28-47
• 2.1 材料和方法28-32
• 2.1.1 水稻黑条矮缩病毒采集、提取和测序28-30
• 2.1.2 核苷酸变异和多样性分析30-31
• 2.1.3 遗传重组和系统发育分析31
• 2.1.4 RNAi载体的构建31-32
• 2.2 结果32-44
• 2.2.1 病毒基因组变异32-36
• 2.2.2 核苷酸多样性分析36-37
• 2.2.3 遗传重组检测37-38
• 2.2.4 系统发育分析38-39
• 2.2.5 序列保守区预测39-43
• 2.2.6 RNAi载体构建43-44
• 2.3 讨论44-47
• 2.3.1 RBSDV序列变异44-45
• 2.3.2 RBSDV的重组和分类45
• 2.3.3 RNAi技术在玉米抗RBSDV研究中的应用45-47
• 第三章 水稻黑条矮缩病毒的选择响应47-59
• 3.1 材料和方法47-49
• 3.1.1 病毒采集、dsRNA提取和测序47
• 3.1.2 密码子使用偏性分析47-48
• 3.1.3 对应分析和主要偏爱密码子的确定48
• 3.1.4 自然选择效应和中性检测48
• 3.1.5 遗传分化和基因流分析48-49
• 3.2 结果49-57
• 3.2.1 RBSDV碱基成分分析49-50
• 3.2.2 影响病毒密码子使用因素分析50-53
• 3.2.3 主要偏爱密码子的确定53
• 3.2.4 自然选择效应分析53
• 3.2.5 群体中性测试53-54
• 3.2.6 遗传分化和基因流分析54-57
• 3.3 讨论57-59
• 3.3.1 影响RBSDV密码子使用的原因分析57
• 3.3.2 病毒自然选择57
• 3.3.3 病毒群体遗传结构57-59
• 第四章 水稻黑条矮缩病毒胁迫玉米响应途径分析59-81
• 4.1 材料和方法59-62
• 4.1.1 供试材料59
• 4.1.2 人工接种病毒和玉米样品采集59
• 4.1.3 人工接种病毒的鉴定59-60
• 4.1.4 转录组、miRNA和降解组测序60
• 4.1.5 转录组和miRNA分析60-61
• 4.1.6 玉米叶片组织细胞分析61-62
• 4.2 结果62-79
• 4.2.1 RBSDV人工接种的鉴定62-64
• 4.2.2 测序数据统计分析64
• 4.2.3 玉米转录组响应RBSDV差异表达分析64-72
• 4.2.4 玉米miRNA响应RBSDV差异表达分析及靶基因鉴定72-74
• 4.2.5 RBSDV致病途径联合分析74-79
• 4.3 讨论79-81
• 4.3.1 玉米响应RBSDV基因特征分析79-80
• 4.3.2 RBSDV导致玉米粗缩病致病途径80-81
• 第五章 全文结论81-82
• 参考文献82-96
• 附录96-118
• 致谢118-119
• 作者简历119

【参考文献】

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