鱼类TRIM基因系统进化分析及免疫功能研究

发布时间：2017-05-03 05:16

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【摘要】：TRIM蛋白是以N端三重基序(Ring锌指结构域、一个或两个B-Boxes结构域和一个Coiled-coil结构域)为特征而C端含有不同类型结构域的一类蛋白的统称,因此TRIM蛋白又被称为RBCC蛋白。TRIM蛋白是一个古老的蛋白家族,存在于所有多细胞动物中,但每个物种中的数量不尽相同,并随着脊椎动物的进化而快速扩张形成庞大的蛋白家族。TRIM蛋白保守的结构域组成也预示其在细胞生命活动中具有共同的生化功能。研究显示TRIM蛋白作为一类E3泛素连接酶参与了细胞分化、细胞周期调控、凋亡、转录调节和先天性免疫信号通路等生命过程。相对于人源TRIM基因丰富的研究成果,鱼类来源的TRIM基因则鲜有报道。本研究针对鱼类来源的TRIM基因进行系统进化分析及多样性研究,探讨鱼类TRIM基因的进化方向和多样性,并以嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染的斑马鱼(Danio rerio)为模型研究鱼类TRIM基因在细菌侵染过程中对固有免疫信号通路的调节作用。本研究系统分析斑马鱼基因组中所有198个TRIM基因,包括染色体定位、剪接体个数和结构域组成等,首次发现四个C端不同结构域的TRIM蛋白,这在其它物种中还没有报道过。另外,首次对软骨鱼象鼻鲨(Callorhinchus milii)基因组通过Blast比对分析,共发现57条TRIM基因序列。通过对斑马鱼、象鼻鲨和人类部分TRIM蛋白序列构建系统进化树分析,发现在斑马鱼和象鼻鲨中分别有3个(ftr、btr和trim35)和1个(zinc binding A33 like protein)基因亚家族,每个亚家族均含有多个基因成员,且与人类TRIM基因没有同源性,表明软骨鱼、硬骨鱼和人类的TRIM基因有着不同的进化方向,且鱼类基因多样性更加丰富。通过基因同线性分析结果表明,斑马鱼TRIM基因在进化中经历了适应性进化和快速扩张,并发生基因复制、分化和缺失等遗传事件,形成庞大的TRIM基因家族。结果表明鱼类TRIM基因受环境压力选择明显,进化更加迅速,基因多样性更加丰富,并且在免疫系统中扮演重要作用。首次从软骨鱼条纹斑竹鲨(Chiloscyllium plagiosum)中克隆得到两个TRIM基因Cptrim35和Cptrim39,基因全长分别为1,935 bp和1,829 bp,分别编码537和488个氨基酸。Cptrim35基因具有三种不同的剪接体。结构域分析表明两个TRIM蛋白的C端都是B30.2结构域。系统进化分析表明这两个TRIM蛋白与硬骨鱼来源的同源TRIM蛋白处于同一进化分支中,但比硬骨鱼TRIM蛋白更古老。通过定量PCR技术检测了Cptrim35和Cptrim39基因在条纹斑竹鲨各组织分布情况和攻毒后差异表达分析。通过分析Cptrim35和Cptrim39蛋白在细胞中的定位以及Ring结构域的E3泛素连接酶活性,表明条纹斑竹鲨来源的Cptrim35和Cptrim39作为一类依赖Ring结构域的E3泛素连接酶在机体抵抗病原微生物的过程中发挥重要作用。以嗜水气单胞菌(A.hydrophila)侵染斑马鱼为模型,首次分析了斑马鱼TRIM基因在细菌侵染过程中的差异表达情况,筛选获得部分差异表达显著的TRIM基因,包括trim1、trim16、trim19、trim23、btr20、btr24、trim35-21、trim35-28、ftr24和ftr43等。利用RT-q PCR技术和RNAi技术进一步分析了btr20基因在整个侵染过程中的表达变化以及与NF-κB基因的相互表达关系,证明斑马鱼btr20基因在先天性免疫信号通路中起到重要调节作用。为进一步了解斑马鱼TRIM蛋白在免疫信号通路中的调节作用,利用酵母双杂交技术在斑马鱼脾脏c DNA杂交文库中对trim1和trim23蛋白进行互作蛋白的筛选,得到一些与免疫信号通路相关的互作蛋白,其中trim1的互作蛋白有sestrin,trim23的互作蛋白有Uba52、Ubc E2I、lectin和cp-2。trim23和Ubc E2I的体外互作实验证明两个蛋白具有互作关系。综上所述,本研究通过对鱼类TRIM基因系统进化分析和细菌侵染过程中的差异表达分析,表明鱼类TRIM基因受环境压力选择明显,进化更加迅速,编码的蛋白质作为E3泛素连接酶在免疫系统中发挥重要作用。筛选得到部分互作的信号通路蛋白,为进一步了解TRIM蛋白对免疫信号通路的调节机理提供了必要的材料。
【关键词】：TRIM 斑马鱼 软骨鱼 系统进化分析 细菌侵染 互作蛋白
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-18
• 英文缩略表18-19
• 第一章 绪论19-34
• 1.1 TRIM蛋白19-30
• 1.1.1 TRIM蛋白各结构域特征及功能19-24
• 1.1.2 泛素化系统24-26
• 1.1.3 TRIM蛋白在免疫系统中的功能26-28
• 1.1.4 TRIM蛋白表达特征28-30
• 1.2 TRIM蛋白的分类及进化30-32
• 1.2.1 TRIM蛋白的分类30-31
• 1.2.2 TRIM蛋白的进化31-32
• 1.3 鱼类TRIM基因研究现状32-33
• 1.4 本研究的目的及意义33-34
• 第二章 鱼类TRIM基因系统进化分析34-50
• 第一节 斑马鱼TRIM基因多样性分析34-45
• 1.1 斑马鱼TRIM基因序列及蛋白质序列资源的获得34
• 1.2 实验方法34
• 1.2.1 斑马鱼TRIM蛋白分类34
• 1.2.2 斑马鱼TRIM基因在染色体上定位及同线性分析34
• 1.2.3 斑马鱼TRIM基因序列比对和系统发生分析34
• 1.3 结果与分析34-41
• 1.3.1 斑马鱼TRIM蛋白分类34-36
• 1.3.2 斑马鱼TRIM基因在染色体上的定位及同线性分析36-39
• 1.3.3 RBCC-B30.2 TRIM蛋白系统发生分析39-41
• 1.4 讨论41-43
• 1.5 小结43-45
• 第二节 鱼类TRIM基因系统进化分析45-50
• 2.1 序列资源45
• 2.2 实验方法45
• 2.2.1 象鼻鲨TRIM蛋白分类45
• 2.2.2 鱼类TRIM基因序列比对、同线性分析和系统发生分析45
• 2.3 结果与分析45-48
• 2.3.1 象鼻鲨TRIM蛋白分类45-46
• 2.3.2 鱼类TRIM蛋白系统发生分析46-48
• 2.4 讨论48
• 2.5 小结48-50
• 第三章 条纹斑竹鲨TRIM基因克隆及免疫功能研究50-84
• 第一节 条纹斑竹鲨TRIM基因克隆及进化分析50-65
• 1.1 实验材料50-51
• 1.1.1 材料50
• 1.1.2 菌株、质粒与引物50
• 1.1.3 试剂与工具酶50
• 1.1.4 溶液和培养基50
• 1.1.5 主要实验仪器及材料50-51
• 1.2 实验方法51-57
• 1.2.1 条纹斑竹鲨脾脏组织总RNA的提取51
• 1.2.2 逆转录反应获得第一链cDNA51-52
• 1.2.3 TRIM基因简并引物的设计52
• 1.2.4 条纹斑竹鲨TRIM基因保守区片段的克隆52-54
• 1.2.5 条纹斑竹鲨TRIM基因全长序列的获得54-56
• 1.2.6 条纹斑竹鲨TRIM基因进化分析56-57
• 1.3 结果与分析57-64
• 1.3.1 TRIM基因简并引物的设计57
• 1.3.2 条纹斑竹鲨TRIM基因保守区片段的扩增57-58
• 1.3.3 Cptrim35和Cptrim39全长基因的获得58
• 1.3.4 序列比对及进化分析58-64
• 1.4 讨论64
• 1.5 小结64-65
• 第二节 条纹斑竹鲨Cptrim35基因功能研究65-76
• 2.1 实验材料65-66
• 2.1.1 实验用鱼、菌株、细胞、质粒与载体65
• 2.1.2 引物65
• 2.1.3 试剂与工具酶65-66
• 2.1.4 主要实验仪器66
• 2.2 实验方法66-72
• 2.2.1 条纹斑竹鲨Cptrim35基因组织分布及攻毒后差异表达分析66-67
• 2.2.2 条纹斑竹鲨Cptrim35亚细胞定位的研究67-70
• 2.2.3 Cptrim35、Ring缺失体及其剪接体的体外泛素化检测70-72
• 2.3 结果与分析72-75
• 2.3.1 条纹斑竹鲨Cptrim35基因各组织分布分析72
• 2.3.2 LPS和poly I:C攻毒后表达差异分析72-73
• 2.3.3 Cptrim35及其剪接体在HEK293T细胞中的定位73-74
• 2.3.4 Cptrim35及其剪接体的体外自我泛素化活性检测74-75
• 2.4 讨论75-76
• 第三节 条纹斑竹鲨Cptrim39基因功能研究76-84
• 3.1 实验材料76
• 3.1.1 实验用鱼、菌株、细胞、质粒与载体76
• 3.1.2 引物76
• 3.1.3 主要试剂与工具酶76
• 3.1.4 主要实验仪器76
• 3.2 实验方法76-79
• 3.2.1 条纹斑竹鲨Cptrim39基因组织分布及攻毒后差异表达分析76-77
• 3.2.2 条纹斑竹鲨Cptrim39亚细胞定位的研究77-78
• 3.2.3 Cptrim39及Ring缺失体的体外泛素化检测78
• 3.2.4 数据处理78-79
• 3.3 结果与分析79-82
• 3.3.1 条纹斑竹鲨Cptrim39基因组织分布分析79-80
• 3.3.2 Cptrim39基因NJ-1 攻毒后表达差异分析80-81
• 3.3.3 Cptrim39亚细胞定位81-82
• 3.3.4 Cptrim39体外自我泛素化活性检测82
• 3.4 讨论82-83
• 3.5 小结83-84
• 第四章 TRIM基因在嗜水气单胞菌侵染斑马鱼模型中功能研究84-107
• 第一节 嗜水气单胞菌侵染斑马鱼模型的建立84-87
• 1.1 实验材料84-85
• 1.1.1 实验用鱼及菌株84
• 1.1.2 引物84
• 1.1.3 主要试剂84
• 1.1.4 主要实验仪器84-85
• 1.2 实验方法85
• 1.2.1 嗜水气单胞菌（A. hydrophila）NJ-1 感染斑马鱼85
• 1.2.2 斑马鱼相关免疫因子检测85
• 1.3 结果与分析85-86
• 1.3.1 攻毒菌体浓度及攻毒时间的确定85-86
• 1.3.2 RT-qPCR检测攻毒后免疫因子变化86
• 1.4 讨论86-87
• 第二节TRIM基因差异表达的筛选87-91
• 2.1 实验材料87
• 2.1.1 实验用鱼及菌株87
• 2.1.2 引物87
• 2.1.3 主要试剂87
• 2.1.4 主要实验仪器87
• 2.2 实验方法87
• 2.2.1 RT-qPCR引物验证87
• 2.2.2 攻毒后斑马鱼TRIM基因表达水平检测87
• 2.2.3 数据处理87
• 2.3 结果与分析87-90
• 2.3.1 斑马鱼泛素化系统中相关基因差异表达分析87-88
• 2.3.2 斑马鱼TRIM基因差异表达分析88-90
• 2.4 讨论90-91
• 第三节btr20基因功能研究91-99
• 3.1 实验材料91
• 3.1.1 实验用鱼、菌株、细胞、质粒与载体91
• 3.1.2 引物91
• 3.1.3 主要试剂与工具酶91
• 3.1.4 主要实验仪器91
• 3.2 实验方法91-94
• 3.2.1 斑马鱼btr20基因组织分布及攻毒后差异表达分析91-92
• 3.2.2 btr20亚细胞定位的研究92
• 3.2.3 btr20体外泛素化检测92-93
• 3.2.4 btr20基因在ZF4细胞中的敲除实验93-94
• 3.2.5 数据处理94
• 3.3 结果与分析94-98
• 3.3.1 btr20基因组织分布及攻毒后差异表达检测94-96
• 3.3.2 btr20亚细胞定位96-97
• 3.3.3 btr20体外与不同泛素结合酶E2的自我泛素化活性检测97
• 3.3.4 btr20在ZF4细胞中敲除后引起NF-κB下调表达97-98
• 3.4 讨论98-99
• 第四节 斑马鱼TRIM蛋白互作蛋白的筛选及验证99-107
• 4.1 实验材料99
• 4.1.1 实验用鱼99
• 4.1.2 菌株和质粒99
• 4.1.3 试剂和工具酶99
• 4.1.4 试剂和培养基的配制99
• 4.2 实验方法99-102
• 4.2.1 TRIM-pGBKT7融合载体的构建99-100
• 4.2.2 诱饵蛋白的自激活检测100
• 4.2.3 诱饵蛋白对宿主细胞毒性的检测100
• 4.2.4 斑马鱼脾脏组织Y2H cDNA文库的建立100-101
• 4.2.5 诱饵菌株和文库宿主菌的双杂交101
• 4.2.6 表达相互作用蛋白酵母二倍体的筛选101
• 4.2.7 计算融合效率和可筛选的克隆数101
• 4.2.8 分析阳性相互作用101
• 4.2.9 候选蛋白的pull-down验证101-102
• 4.3 实验结果102-105
• 4.3.1 TRIM蛋白诱饵质粒的构建102-103
• 4.3.2 TRIM诱饵蛋白自激活检测103
• 4.3.3 TRIM诱饵蛋白对酵母宿主细胞的毒性检测103
• 4.3.4 斑马鱼脾脏cDNA文库的构建及质量鉴定103-104
• 4.3.5 trim1和trim23诱饵蛋白与cDNA文库的杂交筛选互作蛋白104
• 4.3.6 trim23蛋白与UbcE2I蛋白的pull-down验证104-105
• 4.4 讨论105-106
• 4.5 本章小结106-107
• 第五章 全文结论与展望107-108
• 参考文献108-118
• 附录118-131
• 致谢131-132
• 作者简历132

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1 张新尚;鱼类TRIM基因系统进化分析及免疫功能研究[D];中国农业科学院;2015年

  本文关键词：鱼类TRIM基因系统进化分析及免疫功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：342408