基于抗体的拟除虫菊酯农药代谢物分析和Cry2Aa毒素分子模拟研究
发布时间：2021-10-30 06:54
抗体是由脊椎动物产生的一种能高亲和力、特异性识别抗原的多功能分子。在植物保护领域,抗体即可作为农药残留免疫分析的生物识别分子,又可用于农药的分子模拟,替代其与靶标昆虫受体结合,甚至引发生物学效应。本研究从抗体的生物识别和分子模拟两大功能着手,开展了多种拟除虫菊酯农药共性代谢产物3-苯氧基苯甲酸（3-PBA）免疫分析技术研究。同时采用抗独特型抗体技术对苏云金芽孢杆菌（Bt）Cry2Aa毒素进行分子模拟,并对其生物活性与原毒素进行比较研究,具体取得的结果如下:（1）3-PBA胶体金免疫层析法的建立试验采用体内诱生腹水法制备了 3-PBA单克隆抗体,并用Protein G柱进行亲和纯化。用间接竞争ELISA法测定的3-PBA对纯化抗体的抑制中浓度（I50）为0.63 μg/mL,最低检测限（110）为0.13μg/mL,线性检测范围（I20-I80）在0.19-2.04μg/mL之间。用柠檬酸三钠还原法制备了 15nm的胶体金颗粒用于纯化抗体标记,测定的最佳抗体标记浓度为48μg/mL。试验以硝酸纤维素膜为载体,组装了免疫层析试纸,优化的检测线浓度和金标抗体喷膜量分别为2 mg/mL和5μL...
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１抗体分子的基本结构??（图片来自于文献［４］并在此基础上进行了修改
子模拟研究???ＳｃＦｖ?Ｄｉａｂｏｄｙ?Ｕｖ??Ｆａｂ?（－２７ｋＤａ）?＜－５５ｋＤａ）?＜￣５０ｋＤｓ）??卜?Ｓ５?ｋＤａ）?＿?—??／％?＾?｜?％?＾?＾＾?０??ｘ?＃?＼??Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ?Ｔｒｉａｂｏｃｆｙ??八?灣?Ｃ－ｌＯＯｋＤａ）?（￣７５ｋＤａ）??Ｆａｂ２???????ＨｌＯｋＤａ）?丨?｜Ｖ?３，??｜ＶＨ??Ｍ?ｃｈｚ?１１?１１?Ｊ１＇??翟?ｃＨ３１＃?％ｔ??｛￣Ｌ１ｋ）?卵■）?一??图１－２重组抗体及天然抗体的类型（图片引自文献［８］）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ａｎｄ?ｎａｔｕｒａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??（Ｔｈｉｓ?ｆｉｇｕｒｅ?ｗａｓ?ａｄａｐｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?［８］）??２．３．１来源于单抗的重组抗体??从单抗细胞株为基础构建重组抗体主要涉及以下几个步骤：（１）利用ＰＣＲ技??术扩增杂交瘤细胞株抗体基因；（２）抗体基因克隆至合适的表达载体；（３）重组??抗体的功能性表达。１９９３年Ｗａｒｄ等首次报道了从识别阿特拉津的杂交瘤细胞中??克隆抗体基因，构建至ｐＥＴ３ｄ载体后，在大肠杆菌表达系统中成功表达出识别??阿特拉津的Ｆａｂ片段［９］。至今，已有包括百草枯、对硫磷、毒死蜱、敌草隆等多??种来源于单克隆抗体的重组抗体报道［１（）］。其中，一些抗体与母体单克隆抗体相似，??或者其抗体性能发生改变。这些性质的差异可能来源于抗体化合价的变化（如??ＩｇＧ具有两个抗原识别区，而Ｆａｂ和ｓｃＦｖ仅有一个抗原识别区），以及在杂交瘤??抗体基因扩增
第一章文献综述??Ａｂ２ｙ??八＾２?６?Ａｎｔｉｇｅｎ??Ａｂｌ?Ｉ??Ａｂ２Ｐ??Ａｂ２ａ??图１－４抗独特型抗体的类型??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔ＞?ｐｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??４．２抗独特型抗体与生物受体??生物受体是可与配体（激素、神经递质、药物、细胞内信号分子）结合并引??起细胞功能变化的生物大分子。抗独特型抗体又是怎样与生物受体产生联系的呢？??如图１－５所示，是一个抗独特型抗体模拟抗原结构，与其受体发生结合从而引发??生物学效应的示例。即用一种抗原（配体）免疫动物后，将诱导产生抗体（Ａｂｌ?），??Ａｂｌ的抗原识别部位即“独特型”（Ｉｄ）又可以诱导机体淋巴细胞产生抗独特型抗??体（Ａｂ２）。其中，部分Ａｂ２?（Ａｂ２ｐ）具有模拟原始抗原的空间结构的能力，能够??替代抗原与其生物受体结合，甚至可以引发与原始抗原相似的生物学活性，抗独??特型抗体从而与生物受体发生了联系。??抗说（．＼ｎｔｉｇｃｎ）??抗療与受体结％▲?ｚ?、｜抗衆与技体结合??引发屮物￥活性?受休?＼ｈｉ?ｊ??Ｉ?丨抗体（Ａｂｌ）??抗往特轚抗体与受体结合抗体与抗法特变抗体结合??Ａｂ２?＜?ｆ?Ａｂ２??ＫＺｗ￣－－－％ｙ??抗独特５？抗体（Ａｂ２＞??图１－５抗独特型抗体替代抗原与其生物受体结合??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ｂｉｎｄ?ｔｏ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ?ａｓ?ｔｈｅ?ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ａｎｔｉｇｅｎ??１３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫机理[J]. 刘媛,林洁茹,林曼曼,张霄,徐重新,陈蔚,罗楚平,刘贤金. 江苏农业学报. 2018(04)
[2]小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟[J]. 张霄,胡晓丹,仲建锋,武爱华,徐重新,刘媛,张存政,谢雅晶,刘贤金. 中国农业科学. 2016(23)
[3]Cry毒素杀虫活性分子改造方法研究进展[J]. 郭雅洁,李苹,伍忠玲,郑茹萍,张俊,胡霞. 生物技术进展. 2016(01)
[4]基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用[J]. 刘媛,林曼曼,张霄,徐重新,焦凌霞,仲建锋,武爱华,刘贤金. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(01)
[5]抗拟除虫菊酯类农药广谱性单克隆抗体的研制及鉴定[J]. 文孟棠,刘媛,闫帅,张霄,王恒,刘贤金. 分析化学. 2014(09)
[6]时间分辨荧光免疫分析方法检测烟草中菌核净残留[J]. 刘媛,刘蓉蓉,刘贤金,方敦煌,宋春满,Huovinen Tuomas,Vehniinen Markus,Lvgren Timo. 分析化学. 2012(07)
[7]Bt杀虫基因专利保护现状与趋势[J]. 张杰,束长龙,张春鸽. 植物保护. 2011(03)
[8]抗独特型抗体在小分子农药、真菌毒素免疫检测中的应用[J]. 刘媛,梁颖,王耘,贺江,刘贤进. 浙江农业学报. 2010(03)
[9]Effect of Nitrogen on the Degradation of Cypermethrin and Its Metabolite 3-Phenoxybenzoic Acid in Soil[J]. XIE Wen-Jun1,2,ZHOU Jian-Min1,2,WANG Huo-Yan1 and CHEN Xiao-Qin1 1State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008(China) 2Shandong Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta,Binzhou University,Binzhou 256603(China). Pedosphere. 2008(05)
[10]苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性[J]. 李海涛,姚江,郭巍,宋福平,高继国,黄大昉,张杰. 农业生物技术学报. 2005(06)
博士论文
[1]典型手性农药拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼的发育毒性研究[D]. 金美青.浙江大学 2010
[2]棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系[D]. 陈利珍.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]小菜蛾中肠Polycalin基因克隆及其功能分析[D]. 杜潇.西北农林科技大学 2016
[2]Bt Cry2Aa毒素基因工程抗体的制备及活性研究[D]. 武爱华.南京农业大学 2015
本文编号：3466274
【文章来源】：南京农业大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：149 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图１－１抗体分子的基本结构??（图片来自于文献［４］并在此基础上进行了修改
子模拟研究???ＳｃＦｖ?Ｄｉａｂｏｄｙ?Ｕｖ??Ｆａｂ?（－２７ｋＤａ）?＜－５５ｋＤａ）?＜￣５０ｋＤｓ）??卜?Ｓ５?ｋＤａ）?＿?—??／％?＾?｜?％?＾?＾＾?０??ｘ?＃?＼??Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ?Ｔｒｉａｂｏｃｆｙ??八?灣?Ｃ－ｌＯＯｋＤａ）?（￣７５ｋＤａ）??Ｆａｂ２???????ＨｌＯｋＤａ）?丨?｜Ｖ?３，??｜ＶＨ??Ｍ?ｃｈｚ?１１?１１?Ｊ１＇??翟?ｃＨ３１＃?％ｔ??｛￣Ｌ１ｋ）?卵■）?一??图１－２重组抗体及天然抗体的类型（图片引自文献［８］）??Ｆｉｇｕｒｅ?１－２?Ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ａｎｄ?ｎａｔｕｒａｌ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??（Ｔｈｉｓ?ｆｉｇｕｒｅ?ｗａｓ?ａｄａｐｔｅｄ?ｆｒｏｍ?ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ?［８］）??２．３．１来源于单抗的重组抗体??从单抗细胞株为基础构建重组抗体主要涉及以下几个步骤：（１）利用ＰＣＲ技??术扩增杂交瘤细胞株抗体基因；（２）抗体基因克隆至合适的表达载体；（３）重组??抗体的功能性表达。１９９３年Ｗａｒｄ等首次报道了从识别阿特拉津的杂交瘤细胞中??克隆抗体基因，构建至ｐＥＴ３ｄ载体后，在大肠杆菌表达系统中成功表达出识别??阿特拉津的Ｆａｂ片段［９］。至今，已有包括百草枯、对硫磷、毒死蜱、敌草隆等多??种来源于单克隆抗体的重组抗体报道［１（）］。其中，一些抗体与母体单克隆抗体相似，??或者其抗体性能发生改变。这些性质的差异可能来源于抗体化合价的变化（如??ＩｇＧ具有两个抗原识别区，而Ｆａｂ和ｓｃＦｖ仅有一个抗原识别区），以及在杂交瘤??抗体基因扩增
第一章文献综述??Ａｂ２ｙ??八＾２?６?Ａｎｔｉｇｅｎ??Ａｂｌ?Ｉ??Ａｂ２Ｐ??Ａｂ２ａ??图１－４抗独特型抗体的类型??Ｆｉｇｕｒｅ?１－４?Ｔｙｐｅｓ?ｏｆ?ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔ＞?ｐｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ??４．２抗独特型抗体与生物受体??生物受体是可与配体（激素、神经递质、药物、细胞内信号分子）结合并引??起细胞功能变化的生物大分子。抗独特型抗体又是怎样与生物受体产生联系的呢？??如图１－５所示，是一个抗独特型抗体模拟抗原结构，与其受体发生结合从而引发??生物学效应的示例。即用一种抗原（配体）免疫动物后，将诱导产生抗体（Ａｂｌ?），??Ａｂｌ的抗原识别部位即“独特型”（Ｉｄ）又可以诱导机体淋巴细胞产生抗独特型抗??体（Ａｂ２）。其中，部分Ａｂ２?（Ａｂ２ｐ）具有模拟原始抗原的空间结构的能力，能够??替代抗原与其生物受体结合，甚至可以引发与原始抗原相似的生物学活性，抗独??特型抗体从而与生物受体发生了联系。??抗说（．＼ｎｔｉｇｃｎ）??抗療与受体结％▲?ｚ?、｜抗衆与技体结合??引发屮物￥活性?受休?＼ｈｉ?ｊ??Ｉ?丨抗体（Ａｂｌ）??抗往特轚抗体与受体结合抗体与抗法特变抗体结合??Ａｂ２?＜?ｆ?Ａｂ２??ＫＺｗ￣－－－％ｙ??抗独特５？抗体（Ａｂ２＞??图１－５抗独特型抗体替代抗原与其生物受体结合??Ｆｉｇｕｒｅ?１－５?Ａｎｔｉ－ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ?ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ?ｂｉｎｄ?ｔｏ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ?ａｓ?ｔｈｅ?ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ａｎｔｉｇｅｎ??１３??
【参考文献】：
期刊论文
[1]Cry2Aa毒素对小菜蛾的杀虫机理[J]. 刘媛,林洁茹,林曼曼,张霄,徐重新,陈蔚,罗楚平,刘贤金. 江苏农业学报. 2018(04)
[2]小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟[J]. 张霄,胡晓丹,仲建锋,武爱华,徐重新,刘媛,张存政,谢雅晶,刘贤金. 中国农业科学. 2016(23)
[3]Cry毒素杀虫活性分子改造方法研究进展[J]. 郭雅洁,李苹,伍忠玲,郑茹萍,张俊,胡霞. 生物技术进展. 2016(01)
[4]基因突变技术在抗体亲和力体外成熟中的应用[J]. 刘媛,林曼曼,张霄,徐重新,焦凌霞,仲建锋,武爱华,刘贤金. 浙江大学学报(农业与生命科学版). 2016(01)
[5]抗拟除虫菊酯类农药广谱性单克隆抗体的研制及鉴定[J]. 文孟棠,刘媛,闫帅,张霄,王恒,刘贤金. 分析化学. 2014(09)
[6]时间分辨荧光免疫分析方法检测烟草中菌核净残留[J]. 刘媛,刘蓉蓉,刘贤金,方敦煌,宋春满,Huovinen Tuomas,Vehniinen Markus,Lvgren Timo. 分析化学. 2012(07)
[7]Bt杀虫基因专利保护现状与趋势[J]. 张杰,束长龙,张春鸽. 植物保护. 2011(03)
[8]抗独特型抗体在小分子农药、真菌毒素免疫检测中的应用[J]. 刘媛,梁颖,王耘,贺江,刘贤进. 浙江农业学报. 2010(03)
[9]Effect of Nitrogen on the Degradation of Cypermethrin and Its Metabolite 3-Phenoxybenzoic Acid in Soil[J]. XIE Wen-Jun1,2,ZHOU Jian-Min1,2,WANG Huo-Yan1 and CHEN Xiao-Qin1 1State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture,Institute of Soil Science,Chinese Academy of Sciences,Nanjing 210008(China) 2Shandong Key Laboratory of Eco-Environmental Science for Yellow River Delta,Binzhou University,Binzhou 256603(China). Pedosphere. 2008(05)
[10]苏云金芽孢杆菌cry2Aa基因的克隆、表达与活性[J]. 李海涛,姚江,郭巍,宋福平,高继国,黄大昉,张杰. 农业生物技术学报. 2005(06)
博士论文
[1]典型手性农药拟除虫菊酯及其代谢产物对斑马鱼的发育毒性研究[D]. 金美青.浙江大学 2010
[2]棉铃虫中肠Cry1A结合蛋白分离、鉴定及其与抗性的关系[D]. 陈利珍.中国农业科学院 2008
硕士论文
[1]小菜蛾中肠Polycalin基因克隆及其功能分析[D]. 杜潇.西北农林科技大学 2016
[2]Bt Cry2Aa毒素基因工程抗体的制备及活性研究[D]. 武爱华.南京农业大学 2015
本文编号：3466274
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