大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白磷酸化修饰在病毒侵染和运动中的功能分析

发布时间：2017-05-08 08:17

  本文关键词：大麦条纹花叶病毒TGB1蛋白磷酸化修饰在病毒侵染和运动中的功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)是大麦病毒属(Hordeivirus)的典型成员,其编码的TGB1是一个多功能运动蛋白,具有RNA结合、RNA解旋酶和自身互作等功能。TGB1通过与TGB3蛋白的直接互作、与TGB2蛋白的间接作用来实现病毒的胞间运动。同时,TGB1蛋白还是BSMV对短柄草(Brachypodium distachyon)的致病决定因子,ND18株系(NDBSMV)编码的NDTGB1蛋白可被短柄草的R基因Bsrl识别并诱发抗性反应。然而,关于BSMV TGB1蛋白的磷酸化修饰尚未见报道。 以BSMV新疆株系(XJBSMV)为研究对象,利用磷酸化特异抗体检测XJBSMV侵染的本生烟叶片、原核表达纯化的xjTGB1蛋白为底物的体外磷酸化等方法确定了XJTGB1蛋白在体内和体外均能被激酶CK2磷酸化。通过软件预测、液相色谱-质谱联用分析(LC-MS/MS)、XJTGB1及其突变体蛋白的体外磷酸化实验,证明了其主要磷酸化位点为第401位的苏氨酸(Thr-401),并首次揭示第395位的苏氨酸(Thr-395)是CK2激酶的磷酸化锚定位点(docking site)。以XJBSMV的侵染性克隆为骨架,将Thr-395和Thr-401位点进行不同的点突变并接种大麦、小麦和本生烟,结果表明,与野生型病毒相比,各突变体病毒的致病性和侵染效率均有不同程度的下降。通过观察和比较各突变体病毒的胞间运动情况,证明了部分突变体系统侵染能力的丧失主要是由于病毒的胞间运动受到明显抑制所致。GST pull-down的实验结果表明,磷酸化是通过影响TGB1和TGB3蛋白的互作来调节TGB1运动蛋白的功能,进而影响病毒的侵染性。 XJBSMV能系统侵染玉米自交系B73,而NDBSMV则不能,为了确定BSMV不同株系对B73的致病关键因子,通过NDBSMV和XJBSMV不同RNA组分的重配和RNAβ的片段重组,并对玉米进行摩擦接种实验,证实XJBSMV对B73的致病关键因子为RNAp编码的XJTGB1蛋白,通过定点突变进一步将致病关键氨基酸定位到403位的谷氨酸(Glu-403)。鉴于TGB1蛋白的磷酸化修饰对病毒运动的调控作用,在探究TGB1作为玉米致病关键因子机制的过程中,利用原核表达纯化了NDTGB1和XJTGB1蛋白在Glu-403位点以及磷酸化位点的各种突变体蛋白,比较并分析这些蛋白被玉米CK2激酶的磷酸化程度。同时,以NDBSMV和XJBSMV的侵染性克隆为骨架,构建相应的突变体并对玉米进行接种实验,结果表明,突变体蛋白的磷酸化水平与相应突变体病毒的侵染性之间并未呈现严格的正相关,说明TGB1蛋白的磷酸化修饰与XJBSMV对玉米的致病性没有直接的关联,可能有其它寄主因子的参与。 为了进一步研究BSMV的致病性分化,构建了BSMV部分株系的侵染性克隆。同时,以本实验室收集和保存的BSMV六种株系为毒源,通过汁液摩擦或农杆菌浸润的方法分别接种玉米、谷子、高粱、普通烟和本生烟。结果显示,BSMV不同株系对不同寄主上的致病性差异较大,BSMV对本生烟的致病力可能是由RNAβ和RNAγ共同决定的。这些结果为分析BSMV在不同寄主上的致病性分化以及病毒侵染机制提供了新的参考数据。
【关键词】：大麦条纹花叶病毒 TGB1蛋白 磷酸化修饰 CK2激酶 致病决定因子
【学位授予单位】：中国农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S435.121.4
【目录】：

• 摘要4-5
• Abstract5-7
• 缩略词表7-11
• 第一章 文献综述11-37
• 1.1 植物病毒蛋白的磷酸化及其对病毒侵染的调节作用11-31
• 1.2 大麦条纹花叶病毒及其对不同寄主的致病性差异31-36
• 1.3 本论文的研究目的和意义36-37
• 第二章 材料与方法37-51
• 2.1 实验材料37-38
• 2.2 试剂配制38-43
• 2.3 实验方法43-51
• 第三章 xJBSMV TGB1蛋白的磷酸化对病毒致病性的影响51-77
• 3.1 TGB1蛋白的原核表达、纯化及其抗体制备51-55
• 3.2 _(XJ)TGB1蛋白的体内磷酸化(In vivo phosphorylation)55-56
• 3.3 _(XJ)TGB1蛋白的体外磷酸化(In vitro phosphorylation)56-58
• 3.4 蛋白激酶2(CK2)对_(XJ)TGB1蛋白的磷酸化验证58-65
• 3.5 _(XJ)TGB1蛋白的磷酸化对BSMV病毒致病性的作用及机制65-75
• 3.6 小结与讨论75-77
• 第四章 BSMV不同株系对玉米的致病性差异及机制分析77-96
• 4.1 BSMV各株系对玉米的致病性差异77-80
• 4.2 TGB1蛋白是BSMV对玉米B73致病的关键因子80-85
• 4.3 _(XJ)BSMV磷酸化位点突变体对玉米的致病性研究85-87
• 4.4 _(ND)BSMV磷酸化位点突变体对大麦和玉米的致病性87-89
• 4.5 _(ND)TGB1和_(XJ)TGB1蛋白上致病关键位点突变体的磷酸化89-94
• 4.6 小结与讨论94-96
• 第五章 BSMV对不同寄主植物的侵染性研究96-113
• 5.1 BSMV各株系对不同寄主的侵染性研究96-101
• 5.2 BSMV不同株系侵染性克隆的构建101-103
• 5.3 BSMV各株系侵染性克隆对本生烟的致病性验证103-104
• 5.4 BSMV各株系对本生烟的致病力差异分析104-108
• 5.5 小结与讨论108-113
• 结论与展望113-114
• 参考文献114-124
• 致谢124-126
• 个人简历126-128
• 附录 引物列表128-132

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 彭学贤,蔡发兴,孙薇,莽克强;大麦条纹花叶病毒新疆分离物是三组分RNA病毒[J];病毒学报;1986年03期

2 于善谦;王鸣岐;陈仲宜;张若平;;种传大小麦病毒病的研究(Ⅰ)——大麦条纹花叶病毒在我国的证实[J];复旦学报(自然科学版);1980年04期

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本文编号：350799