河南省免疫猪场伪狂犬病毒分离株生物学特性研究及gE、TK基因双缺失毒株的构建
发布时间：2021-11-28 05:29
伪狂犬病（Pseudorabies,PR）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）引起的、可导致多种家畜及野生动物发病的急性传染病。猪是该病的自然宿主,可造成母猪的死胎和早产,长久以来,给世界养猪业造成了巨大的损失。美国、日本、丹麦等一些发达国家已经在本国养殖场中对该病进行了净化,并且成功根除了PR。然而,我国目前尚未启动此类项目,我国目前对于该病的防制,主要还是以Bartha-K61、Ea、HB-98等传统疫苗对猪群进行预防免疫为主要手段。近30年中,该病的控制一直相对稳定,然而近些年的一些研究表明,在很多地区的猪场中出现了新的变异毒株,这给猪场的预防免疫又造成了新的困难。2015年,河南信阳地区某猪场爆发PR,本研究从死亡的仔猪体内采集病料,在VERO细胞中进行分离,经过三轮增殖和纯化,分离毒株在VERO细胞上出现了典型的病变,包括细胞变圆、肿大以及形成较大的合胞体,成功分离到一株PRV毒株,命名为HNXY。对分离毒株7个重要的抗原及毒力相关基因（gB、gC、gD、gE、TK、RR1、RR2）进行了测序,同以Bartha、kaplan和Becker为代表的早期...
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PRV基因组两种不同的异构体模式图
抗体中和试验：采集的猪场经 Bartha-K61 疫苗免疫的血清，经 56℃灭活30min，用 DMEM 进行 2 倍比稀释，选取 21-28稀释度的血清各50μL分别与50μL含有 200 TCID50的 HNXY 或 Bartha -K61 病毒液混合均匀，与 37℃温箱中孵育1h 后加到入长满单层 VERO 细胞的 96 孔板中，每个稀释度做 8 个重复，同时设置阴性血清对照和无血清空白对照，于 37℃ 5% CO2培养箱培养，每天观察读取结果，最后计算中和效价。4.2 结果4.2.1 病毒分离与纯化外源病毒检测结果均为阴性，而 PRV 的 gE 基因的检测为阳性（图 4.1），阳性率为 48%。其中，PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、JEV、PPV、PEDV 阳性对照大小分别为 1740bP、235bp、1154bp、436bp、375bp、313bp、651bp。
4.2.2 分离毒株重要基因的同源性与遗传进化分析将分离株的 7 个基因同以 Bartha、kaplan 和 Becker 为代表的早期欧美毒株进行核苷酸和氨基酸的序列比对后发现，二者的同源性除 TK 基因高，在 99%以上，其余基因同源性基本都在 99%以下。同稍早的 90 年代以前分离的中国毒株 SC、LA、Ea、Fa 比，gB、gC、gD、gE 基因的同源性几乎在 99.5%以下，TK、RR1、RR2 基因的同源性则在 99.5%以上。同 2012 年以后的中国流行毒株比同源性最高，所有基因基本都在 99.5%以上（表 4.4）。表 4.4 分离株同其它毒株重要基因的同源性比对结果Table 4.4 Sequence comparisons between isolate HNXY and other PRV strains图 4.2 分离毒株 HNXY 在 VERO 细胞上的病变情况（100×）Figure 4.2 The CPE of isolate HNXY in VERO cells(100×)A：正常 VERO 细胞对照；B：分离毒株 HNXY 在 VERO 细胞上的病变
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达PEDV中国变异株S基因重组猪伪狂犬病病毒的构建和纯化[J]. 杨盼盼,吴艳阳,杨东东,高冬生,王川庆,赵军,李存法. 中国兽医学报. 2018(06)
[2]表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其生物学特性分析[J]. 韩爽,陈晓春,邓永,吴华伟,曹明慧,李俊平,夏业才. 中国兽药杂志. 2018(05)
[3]伪狂犬病病毒变异株EP0基因缺失株的构建及其致病力评价[J]. 刘继婷,汤艳东,王同云,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2018(04)
[4]猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究[J]. 潘慧,李艳华,向柯宇,唐栋,程珍珠,罗永文,琚春梅. 华南农业大学学报. 2018(02)
[5]2016年江苏省猪伪狂犬病血清流行病学调查[J]. 徐小艳,徐正军,王相子,开妍,陈昌海. 中国动物检疫. 2018(01)
[6]猪伪狂犬病病毒山东分离株gE和gD基因的克隆及序列分析[J]. 张玲玲,时建立,彭喆,徐胜男,郑书轩,吴晓燕,徐绍建,王金宝,李俊. 中国兽医学报. 2017(11)
[7]核酸疫苗免疫机制研究新进展[J]. 赵佳琪,马春平,张东红,范业宁,吕扬,赵臣. 吉林医药学院学报. 2017(05)
[8]2013～2016年广西猪伪狂犬病流行病学调查分析[J]. 秦树英,许力士,覃念,薛辉,钟莲,刘芳,蹇慧,韦祖樟,陈樱,欧阳康,黄伟坚. 南方农业学报. 2017(10)
[9]使用CRISPR/Cas9技术构建新型重组伪狂犬病毒疫苗的初步研究[J]. 于之清,童武,郑浩,李国新,高飞,王涛,梁超,叶超,武吉强,黄勤峰,童光志. 中国动物传染病学报. 2017(04)
[10]貂源伪狂犬病毒DL14/08株免疫原性及其保护效果的研究[J]. 李欣彤,刘昊,刘帅,胡博,王洋,鲁荣光,吕爽,朱言柱,白雪,张蕾,张海玲,薛向红,史宁,范思宁,赵辉,王雅文,廉士珍,赵秀宇,陈冠华,闫喜军. 中国预防兽医学报. 2017(07)
博士论文
[1]猪伪狂犬病病毒（HNX株）的生物学特性与比较基因组学研究[D]. 余腾.华中农业大学 2016
[2]我国猪伪狂犬病病毒变异株全基因组序列分析及其gE/gI基因缺失灭活疫苗免疫特性[D]. 顾真庆.南京农业大学 2014
[3]伪狂犬病病毒细菌人工染色体的构建及应用[D]. 苏鑫铭.南京农业大学 2006
[4]猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的研究[D]. 徐志文.四川农业大学 2003
硕士论文
[1]利用BAC克隆构建PRV UL21缺失株及其生物学特性研究[D]. 陈毓欣.华中农业大学 2017
[2]猪伪狂犬病病毒变异株gE/gl/TK三基因缺失株的构建及免疫效力初步研究[D]. 李爽.扬州大学 2017
[3]应用CRISPR/Cas9技术快速敲除伪狂犬病毒毒力基因的研究[D]. 刘继婷.吉林农业大学 2017
[4]免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离株的生物学特性分析[D]. 袁一鸣.西北农林科技大学 2017
[5]伪狂犬病毒变异株JS-2012感染性细菌人工染色体克隆的构建及应用[D]. 王涛.中国农业科学院 2017
[6]利用CRISPR/Cas9技术构建的重组伪狂犬病毒及其生物学特性分析[D]. 刘云.中国农业科学院 2017
[7]猪伪狂犬病病毒gI/gE基因缺失变异株的构建和免疫性评价[D]. 李文慧.山东农业大学 2017
[8]利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗[D]. 梁勋.华中农业大学 2016
[9]伪狂犬病毒变异株JS-2012和基因缺失株JS-2012-Δgl/gE感染小鼠的组织分布和致病性试验[D]. 曹艳云.扬州大学 2016
[10]伪狂犬病病毒gE基因缺失株（LA-A株）的构建及免疫效力研究[D]. 许梦微.南京农业大学 2016
本文编号：3523800
【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
PRV基因组两种不同的异构体模式图
抗体中和试验：采集的猪场经 Bartha-K61 疫苗免疫的血清，经 56℃灭活30min，用 DMEM 进行 2 倍比稀释，选取 21-28稀释度的血清各50μL分别与50μL含有 200 TCID50的 HNXY 或 Bartha -K61 病毒液混合均匀，与 37℃温箱中孵育1h 后加到入长满单层 VERO 细胞的 96 孔板中，每个稀释度做 8 个重复，同时设置阴性血清对照和无血清空白对照，于 37℃ 5% CO2培养箱培养，每天观察读取结果，最后计算中和效价。4.2 结果4.2.1 病毒分离与纯化外源病毒检测结果均为阴性，而 PRV 的 gE 基因的检测为阳性（图 4.1），阳性率为 48%。其中，PRV、CSFV、PCV2、PRRSV、JEV、PPV、PEDV 阳性对照大小分别为 1740bP、235bp、1154bp、436bp、375bp、313bp、651bp。
4.2.2 分离毒株重要基因的同源性与遗传进化分析将分离株的 7 个基因同以 Bartha、kaplan 和 Becker 为代表的早期欧美毒株进行核苷酸和氨基酸的序列比对后发现，二者的同源性除 TK 基因高，在 99%以上，其余基因同源性基本都在 99%以下。同稍早的 90 年代以前分离的中国毒株 SC、LA、Ea、Fa 比，gB、gC、gD、gE 基因的同源性几乎在 99.5%以下，TK、RR1、RR2 基因的同源性则在 99.5%以上。同 2012 年以后的中国流行毒株比同源性最高，所有基因基本都在 99.5%以上（表 4.4）。表 4.4 分离株同其它毒株重要基因的同源性比对结果Table 4.4 Sequence comparisons between isolate HNXY and other PRV strains图 4.2 分离毒株 HNXY 在 VERO 细胞上的病变情况（100×）Figure 4.2 The CPE of isolate HNXY in VERO cells(100×)A：正常 VERO 细胞对照；B：分离毒株 HNXY 在 VERO 细胞上的病变
【参考文献】：
期刊论文
[1]表达PEDV中国变异株S基因重组猪伪狂犬病病毒的构建和纯化[J]. 杨盼盼,吴艳阳,杨东东,高冬生,王川庆,赵军,李存法. 中国兽医学报. 2018(06)
[2]表达猪瘟E2基因的重组伪狂犬病毒构建及其生物学特性分析[J]. 韩爽,陈晓春,邓永,吴华伟,曹明慧,李俊平,夏业才. 中国兽药杂志. 2018(05)
[3]伪狂犬病病毒变异株EP0基因缺失株的构建及其致病力评价[J]. 刘继婷,汤艳东,王同云,蔡雪辉. 中国预防兽医学报. 2018(04)
[4]猪伪狂犬病病毒流行毒株gE/gI缺失突变株的构建及生物学特性研究[J]. 潘慧,李艳华,向柯宇,唐栋,程珍珠,罗永文,琚春梅. 华南农业大学学报. 2018(02)
[5]2016年江苏省猪伪狂犬病血清流行病学调查[J]. 徐小艳,徐正军,王相子,开妍,陈昌海. 中国动物检疫. 2018(01)
[6]猪伪狂犬病病毒山东分离株gE和gD基因的克隆及序列分析[J]. 张玲玲,时建立,彭喆,徐胜男,郑书轩,吴晓燕,徐绍建,王金宝,李俊. 中国兽医学报. 2017(11)
[7]核酸疫苗免疫机制研究新进展[J]. 赵佳琪,马春平,张东红,范业宁,吕扬,赵臣. 吉林医药学院学报. 2017(05)
[8]2013～2016年广西猪伪狂犬病流行病学调查分析[J]. 秦树英,许力士,覃念,薛辉,钟莲,刘芳,蹇慧,韦祖樟,陈樱,欧阳康,黄伟坚. 南方农业学报. 2017(10)
[9]使用CRISPR/Cas9技术构建新型重组伪狂犬病毒疫苗的初步研究[J]. 于之清,童武,郑浩,李国新,高飞,王涛,梁超,叶超,武吉强,黄勤峰,童光志. 中国动物传染病学报. 2017(04)
[10]貂源伪狂犬病毒DL14/08株免疫原性及其保护效果的研究[J]. 李欣彤,刘昊,刘帅,胡博,王洋,鲁荣光,吕爽,朱言柱,白雪,张蕾,张海玲,薛向红,史宁,范思宁,赵辉,王雅文,廉士珍,赵秀宇,陈冠华,闫喜军. 中国预防兽医学报. 2017(07)
博士论文
[1]猪伪狂犬病病毒（HNX株）的生物学特性与比较基因组学研究[D]. 余腾.华中农业大学 2016
[2]我国猪伪狂犬病病毒变异株全基因组序列分析及其gE/gI基因缺失灭活疫苗免疫特性[D]. 顾真庆.南京农业大学 2014
[3]伪狂犬病病毒细菌人工染色体的构建及应用[D]. 苏鑫铭.南京农业大学 2006
[4]猪瘟伪狂犬病重组病毒活疫苗的研究[D]. 徐志文.四川农业大学 2003
硕士论文
[1]利用BAC克隆构建PRV UL21缺失株及其生物学特性研究[D]. 陈毓欣.华中农业大学 2017
[2]猪伪狂犬病病毒变异株gE/gl/TK三基因缺失株的构建及免疫效力初步研究[D]. 李爽.扬州大学 2017
[3]应用CRISPR/Cas9技术快速敲除伪狂犬病毒毒力基因的研究[D]. 刘继婷.吉林农业大学 2017
[4]免疫猪场猪伪狂犬病病毒分离株的生物学特性分析[D]. 袁一鸣.西北农林科技大学 2017
[5]伪狂犬病毒变异株JS-2012感染性细菌人工染色体克隆的构建及应用[D]. 王涛.中国农业科学院 2017
[6]利用CRISPR/Cas9技术构建的重组伪狂犬病毒及其生物学特性分析[D]. 刘云.中国农业科学院 2017
[7]猪伪狂犬病病毒gI/gE基因缺失变异株的构建和免疫性评价[D]. 李文慧.山东农业大学 2017
[8]利用CRISPR/Cas9和Cre/lox系统构建伪狂犬病毒双基因缺失活疫苗[D]. 梁勋.华中农业大学 2016
[9]伪狂犬病毒变异株JS-2012和基因缺失株JS-2012-Δgl/gE感染小鼠的组织分布和致病性试验[D]. 曹艳云.扬州大学 2016
[10]伪狂犬病病毒gE基因缺失株（LA-A株）的构建及免疫效力研究[D]. 许梦微.南京农业大学 2016
本文编号：3523800
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