苏云金芽胞杆菌毒素Cry2Ab的活化及寡聚化机制研究

发布时间：2021-11-28 16:43

　　Cry毒素（苏云金芽胞杆菌产生的杀虫晶体蛋白）是目前应用最为广泛的微生物杀虫剂,其作用机制包括“原毒素的活化、受体互作、寡聚化和膜穿孔”这三个步骤。目前Cry毒素的研究主要集中在Cry毒素与受体互作上,而关于毒素“活化、寡聚化和膜穿孔”等方面的研究则较少报道。本研究以对小菜蛾具有高毒力的Cry2Ab杀虫蛋白为研究对象,分析Cry2Ab的活化机制,进一步研究Cry2Ab的寡聚化机制并鉴定寡聚化相关的氨基酸残基。主要结果如下所示:利用N端测序证明了小菜蛾中肠液的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶参与了Cry2Ab原毒素的活化（分别在Arg139和Leu144对Cry2Ab原毒素进行了切割）;进一步构建了酶切位点突变的Cry2Ab突变体（R139A,L144A,R139A-L144A）,野生型和酶切位点单突变的Cry2Ab（R139A,L144A）都能被小菜蛾中肠液活化,这三种毒素对小菜蛾也具有较高的杀虫活性;酶切位点双突变的Cry2Ab突变体（R139A-L144A）不能被小菜蛾中肠液活化,同时对小菜蛾的杀虫活性大幅度下降。这些结果表明活化是Cry2Ab发挥杀虫活性的前提,Cry2Ab同时含有两个酶切... 

【文章来源】：厦门大学福建省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：133 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 成孔毒素概述
    1.2 Cry毒素研究进展
        1.2.1 Bt毒素概述
        1.2.2 Cry毒素结构与功能研究
        1.2.3 Cry毒素作用机制
        1.2.4 Cry毒素活化研究
        1.2.5 Cry毒素与受体互作研究
            1.2.5.1 ABCC
            1.2.5.2 APN
            1.2.5.3 Cadherin
            1.2.5.4 ALP
            1.2.5.5 其他受体
        1.2.6 Cry毒素的寡聚化和膜穿孔研究
            1.2.6.1 Cry毒素的寡聚化机制研究
            1.2.6.2 Cry毒素的膜穿孔机制研究
        1.2.7 Cry毒素的定向改造
    1.3 本论文的研究目的与意义
2 材料与仪器
3 实验方法
    3.1 原核表达载体构建
        3.1.1 突变体引物设计
        3.1.2 重叠延伸PCR
        3.1.3 质粒提取与PCR产物回收
        3.1.4 目的片段与载体的酶切与连接
        3.1.5 转化感受态大肠杆菌BL21
        3.1.6 阳性克隆鉴定
        3.1.7 DNA琼脂糖凝胶电泳
    3.2 蛋白表达纯化
        3.2.1 Cry2Ab蛋白诱导表达
        3.2.2 Cry2Ab蛋白纯化
    3.3 小菜蛾相关实验
        3.3.1 小菜蛾饲养
        3.3.2 小菜蛾中肠液制备
        3.3.3 小菜蛾中肠液活化相关实验
        3.3.4 小菜蛾中肠BBMV制备
        3.3.5 小菜蛾生测实验
    3.4 免疫印迹和配体印迹
        3.4.1 免疫印迹
        3.4.2 配体印迹
    3.5 N端测序
    3.6 寡聚化实验
    3.7 分子筛
    3.8 透射电镜实验
    3.9 生物膜干涉实验
    3.10 脂质体泄露实验
    3.11 蛋白质结构预测及分子对接
4 实验结果
    4.1 Cry2Ab活化机制研究
        4.1.1 小菜蛾中肠液活化Cry2Ab原毒素
        4.1.2 N端测序鉴定Cry2Ab活化位点
        4.1.3 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶活化Cry2Ab原毒素
        4.1.4 构建酶切位点突变的Cry2Ab突变体
        4.1.5 酶切位点突变的Cry2Ab突变体原核表达
        4.1.6 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切位点双突变导致Cry2Ab不能被活化
        4.1.7 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶切位点双突变导致Cry2Ab杀虫活性下降
        4.1.8 Cry2Ab的活化机制:一种双保险模型
    4.2 α4-α5螺旋参与Cry2Ab的寡聚化研究
        4.2.1 活化导致Cry2Ab Domain I α4-α5螺旋的暴露
        4.2.2 构建α4-α5螺旋被隐藏和被缺失的Cry2Ab突变体
            4.2.2.1 Cry2Ab突变体R139A-L144A和H5结构分析
            4.2.2.2 Cry2Ab突变体H5原核表达载体构建及蛋白表达纯化
        4.2.3 Cry2Ab突变体R139A-L144A和H5的活化分析
        4.2.4 α4-α5螺旋的隐藏或缺失导致Cry2Ab对小菜蛾的杀虫活性下降
        4.2.5 α4-α5螺旋的隐藏或缺失导致Cry2Ab对小菜蛾中肠的损伤减弱
        4.2.6 α4-α5螺旋的隐藏或缺失不影响Cry2Ab与小菜蛾氨肽酶D3的结合
        4.2.7 α4-α5螺旋的隐藏或缺失不影响Cry2Ab与小菜蛾BBMV的结合
        4.2.8 α4-α5螺旋的暴露促进Cry2Ab寡聚体的形成
    4.3 鉴定α4-α5螺旋参与Cry2Ab寡聚化关键残基
        4.3.1 Cry2Ab α4-α5螺旋双丙氨酸突变体原核表达载体构建
        4.3.2 Cry2Ab α4-α5螺旋双丙氨酸突变体表达纯化及活化研究
        4.3.3 Cry2Ab α4-α5螺旋双丙氨酸突变体寡聚化研究
        4.3.4 Cry2Ab α4-α5螺旋双丙氨酸突变体的杀虫毒力分析
        4.3.5 Cry2Ab α4-α5螺旋单丙氨酸突变体原核表达载体构建
        4.3.6 Cry2Ab α4-α5螺旋单丙氨酸突变体的表达纯化及活化研究
        4.3.7 鉴定Cry2Ab α4-α5螺旋参与寡聚化的关键残基
        4.3.8 Cry2Ab α4-α5螺旋的单丙氨酸突变体的杀虫毒力分析及膜穿孔能力分析
    4.4 Cry2Ab的寡聚化和膜穿孔机制
5 讨论
    5.1 活化是Cry毒素发挥杀虫活性的前提
    5.2 Cry2Ab的活化是种双保险
    5.3 α4-α5螺旋的暴露是Cry2Ab发挥杀虫活性的前提
    5.4 α4-α5螺旋寡聚化和膜穿孔氨基酸残基鉴定
结论
展望
参考文献
博士期间发表论文
博士期间获奖情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]小菜蛾中肠氨肽酶基因PxAPN5的克隆、原核表达及蛋白质同源建模分析[J]. 许炼,高焕娟,潘志针,朱育菁,陈清西,刘波.  昆虫学报. 2014(11)

博士论文
[1]抗Bt小菜蛾的选育、受体基因克隆及PTD对Cry1Ac的增效作用[D]. 杨峰山.中国农业大学 2004



本文编号：3524778