基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析

发布时间：2017-05-09 17:05

  本文关键词：基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：为缓解不断增加的能源需求与有限化石燃料储备以及环境恶化之间的矛盾,寻找更加生态、可持续再生的替代能源已成为未来新能源的发展方向。利用能源植物生产生物柴油与生物酒精类燃料是目前研究的热点。其中,小桐子作为一种新兴的能源植物,因其种子含油量高可制备生物柴油、不与粮食作物争地及改良生态环境等方面的特性而备受关注。由于起源热带,冷害成为限制小桐子产量及种植面积进一步扩大的主要因素。因此,深入研究小桐子的抗冷性形成机制并利用基因工程手段对其进行改良,培育耐冷新品种,是目前亟待解决的种质问题。本研究中,我们通过Illumina Hiseq 2000高通量测序技术对小桐子低温锻炼条件下的转录组(Transcriptome)进行了测序,共获得了55,112,142条clean reads片段,包含4,960,092,780nt。经过从头拼接,共得到106,749条序列重叠群(Contig),平均长度为338bp;进一步组装得到45,251条Unigene序列,平均长度为789bp。通过Blast序列比对与ESTscan软件预测,发现有34,274条Unigenes(75.74%)包含完整或部分的蛋白质编码区(33,362条通过Blast比对得到,912条通过ESTscan软件预测得到)。有35,791条Unigenes注释到了如Nr、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG等不同蛋白质数据库。其中,27,293条Unigenes注释到GO数据库中的61个功能组中;11,887条Unigenes注释到了COG数据库中25个功能蛋白家族中;18,787条Unigenes注释到了KEGG数据库中的128条主要的代谢途径中。另外,45,251条Unigenes中共鉴定到6665个SSR位点,分布于5922条Unigenes中,平均长度12bp,平均发生频率为13.09%,SSR种类主要以单、二及三核苷酸重复为主,共占94.49%。基于转录组测序数据,我们对小桐子12℃低温锻炼12h、24h、48h的叶片材料进行了数字基因表达谱(Digital Gene Expression Profiling,DGE)的测序分析。与对照相比,小桐子经过12℃低温锻炼共发现4185个差异表达基因,在锻炼12h、24h、48h分别有1915、2085、3213个基因表达表现出差异性,在三个锻炼时间点都表现出差异表达的基因有553个。进一步分析表明,经过12℃低温锻炼12h、24h、48h,分别有1211、1302、2516个基因表达上调,同时分别有704、783、697个基因表达下调。上调表达的基因主要涉及电子传递与氧化还原平衡、水解酶与小分子运输蛋白家族、DNA或RNA结合蛋白类、各类转录因子如AP2/ERF与ABC等。对于主要代谢途径分析表明,小桐子在低温锻炼条件下,淀粉的分解代谢加剧,积累的渗透调节可溶性糖可能主要以肌醇、肌醇半乳糖苷以及蔗糖为主。而不依赖aba的cbf冷信号转导途径中,低温锻炼条件下各层次信号转导膜蛋白、激酶、cbf及其它多种转录因子都上调表达,说明cbf信号系统在小桐子抗冷性形成中起着重要作用。同时,小桐子在低温锻炼12h、24h、48h下,新诱导表达基因分别为238、160、330个,其中在不同锻炼时间点都诱导表达的新基因有61个,主要编码转移酶家族、dna结合蛋白家族、受体蛋白家族及氧化还原酶家族等。结合小桐子抗冷相关转录组与数字基因表达谱的测序数据分析结果,本工作还揭示了22个小桐子抗冷相关基因在小桐子抗冷性形成过程中的表达信息,同时也揭示了它们的组织表达特异性。22个基因在根中基本上都有基础表达,但随着低温锻炼时间的延长,其表达量总体表现为先下调后上调的表达模式,一般在12℃低温锻炼24h时达到最大表达量,其中以nsltpa、ga20ox、admt、dxs、pip2、dhn2、lea5表现最为显著。在茎中,所筛选的22个基因有18个对低温锻炼应答不明显,与对照一样都表现为本底表达;gsts、apx1、lea5表达则表现出低温诱导性;而pdi基因表达量甚微。在叶中,22个基因表达差异性最大,大部分基因表现为随低温锻炼时间的延长逐渐上调表达,而且在12℃低温锻炼24h时达到最大表达量。另外,部分低温锻炼新表达基因在对照条件下没有本底表达,这也与数字基因表达谱分析结果一致,如dnaj、chs、lrr-rlk、admt、dxs、apx1等基因。为进一步理解小桐子抗冷性形成机制,我们从小桐子中克隆了低温锻炼下差异表达变化较大的gs3、nsltpa基因,低温新诱导表达的chs、ga20ox基因,抗氧化和维持大分子功能相关的pdi与msra基因,以及cbf基因家族的两个成员cbf1与cbf2基因。氨基酸序列分析表明,gs3包含由7个平行β-折叠及8个氨基酸残基组成的保守活性中心,而nsltpa包含由4对二硫键(由8个cys残基形成)维系的4段α-螺旋构成的基序结构,都属于多基因家族,且分化上存在跳跃现象。chs属于pks家族,存在典型的查耳酮合酶及对苯乙烯合酶活性位点、产物结合位点与丙二酰-coa结合位点;而ga20ox属于2-odd家族,存在双层β-桶结构及h-d-h基序;两者在进化上都较为保守,与其它植物的直系同源蛋白都存在至少70%以上的序列相似性。pdi属于硫氧还蛋白家族,而我们克隆的小桐子pdi蛋白属于典型的l型成员,具有-a-b-b′-a′-结构域排列方式与两个-cghc-催化核心,并具备-kdel-内质网驻留信号,锚定在内质网膜上,发挥二硫键氧化、还原及异构化的功能。msra属于msr家族a亚家族,与该家族中的msrb、frmsr在氨基酸一级序列、高级结构等方面没有同源性,具有a亚家族蛋白的典型-gcgwp-保守序列以及3个α-螺旋包裹的6个β-折叠片层组成的α/β卷状结构;克隆的CBF1基因氨基酸序列中存在一个典型AP2基序,负责结合COR基因的CRT/DRE顺式作用元件,但没有鉴定到保守的Val-Glu-Glu残基,而是仅发现了中间部位的Glu。对其启动子序列分析发现,CBF1基因启动子区域包含典型的TATA框、CAAT框,以及ICE结合元件、MYB结合元件、MYC结合元件,表明CBF1受多种激素等信号的诱导,并参与多种逆境胁迫的应答。同时,重组GS3、nsLTPA、CHS及PDI酵母在低温下的长势都明显好于对照酵母菌,暗示这些基因与小桐子抗冷性直接相关,对于小桐子抗冷性的基因工程改良具有较大应用潜力。总之,我们在本研究中通过高通量测序技术得到了小桐子低温锻炼条件下的转录组数据,通过数字基因表达谱分析揭示了小桐子抗冷相关基因的表达模式及参与的主要代谢途径,并且实验鉴定了22个抗冷相关基因在根、茎及叶中的表达模式。另外,基于以上结果综合筛选,克隆了8个关键基因的全长cDNA,并对其进行了生物信息学分析及功能鉴定。从意义上而言,本研究初步阐明了小桐子低温锻炼下抗冷性形成的分子机制,得到的Unigenes序列极大地丰富了目前NCBI中小桐子的核酸数据库,为后续抗冷相关基因的克隆并通过基因工程手段对小桐子进行改良提供了理论与实践基础。
【关键词】：小桐子 低温锻炼 抗冷性 转录组 数字基因表达谱 基因克隆 酵母表达
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S794.9
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-10
• 缩略词表10-17
• 第1章 研究背景17-49
• 1.1 研究开发和利用能源植物是产业发展战略的需求17-19
• 1.2 发展能源植物与生物柴油产业面临的问题19
• 1.3 小桐子是具有巨大开发潜力的能源植物19-21
• 1.4 小桐子产业化存在的问题21-22
• 1.5 低温胁迫下植物生理、生化及分子调节22-44
• 1.5.1 植物的冷害及其机理22
• 1.5.2 冷害与植物的抗冷性22-35
• 1.5.2.1 膜系统与植物的抗冷性22-27
• 1.5.2.2 抗氧化系统与植物的抗冷性27-30
• 1.5.2.3 细胞内容物与植物抗冷性30-35
• 1.5.3 植物抗冷性的分子生物学35-44
• 1.5.3.1 植物响应低温信号转导系统35-39
• 1.5.3.2 miRNA差异表达与植物抗冷性39-40
• 1.5.3.3 小桐子基因组及抗冷相关功能基因的研究40-44
• 1.6 研究契机44-45
• 1.7 研究内容45-46
• 1.8 研究目标46
• 1.9 研究特色与创新性46
• 1.10 研究技术路线46-49
• 第2章 材料与方法49-70
• 2.1 实验材料49-51
• 2.1.1 小桐子49
• 2.1.2 大肠杆菌49-50
• 2.1.3 酵母菌50
• 2.1.4 克隆载体与表达载体50-51
• 2.2 培养基51-52
• 2.3 抗生素52
• 2.4 菌种保存52-53
• 2.5 实验仪器与设备53
• 2.6 试剂与耗材53-55
• 2.6.1 生化与分子生物学试剂53
• 2.6.2 常用试剂配制53-55
• 2.7 实验方法55-68
• 2.7.1 基因组DNA的提取与纯化（试剂盒）55-56
• 2.7.2 RNA的提取与纯化56-59
• 2.7.2.1 两步裂解法（用于抗冷相关基因的半定量RT-PCR实验）57-58
• 2.7.2.2 试剂盒TransZol法（用于基因克隆实验）58-59
• 2.7.3 核酸的琼脂糖凝胶电泳59
• 2.7.4 反转录或第一链cDNA的合成59
• 2.7.5 PCR反应体系59-61
• 2.7.5.1 Dream Taq DNA Plymerase反应体系及程序59-60
• 2.7.5.2 TransTaq DNA Polymerase High Fidelity (HiFi) 反应体系及程序60
• 2.7.5.3 TransStart Taq DNA Polymerase反应体系及程序60-61
• 2.7.5.4 2×EasyTaq PCR SuperMix反应体系及程序61
• 2.7.6 DNA琼脂糖凝胶纯化回收61-62
• 2.7.7 PCR产物纯化回收62
• 2.7.8 质粒DNA提取62-63
• 2.7.9 大肠杆菌感受态细胞的制备63
• 2.7.10 酵母菌感受态细胞的制备63-64
• 2.7.10.1 LiAc/TE法63
• 2.7.10.2 LiAc法63-64
• 2.7.11 克隆与大肠杆菌的转化64-66
• 2.7.11.1 TA克隆（基因克隆）64-65
• 2.7.11.2 DNA的酶切反应（双酶切）65-66
• 2.7.11.3 DNA的连接反应（酵母表达载体的构建）66
• 2.7.12 酵母菌的转化与阳性验证66-68
• 2.7.12.1 LiAc/TE法66-67
• 2.7.12.2 LiAc法（Gietz法）67-68
• 2.8 分子量标准68
• 2.9 主要的分析软件68-70
• 第3章 低温锻炼提高小桐子抗冷性过程中转录组的解析70-91
• 3.1 研究的内容与目标70
• 3.2 实验材料与方法70-72
• 3.2.1 实验材料70
• 3.2.2 实验方法70-72
• 3.2.2.1 RNA-Seq测序文库的构建70-71
• 3.2.2.2 测序reads去噪及序列从头（de nevo）拼接71-72
• 3.2.2.3 Unigene数据的功能注释、分类及代谢途径分析72
• 3.2.2.4 高表达Unigene数据的功能鉴定72
• 3.2.2.5 抗冷相关代谢途径关键基因的表达分析72
• 3.2.2.6 简单重复序列（SSR）标记位点分析72
• 3.3 结果与分析72-86
• 3.3.1 测序数据处理及统计72-73
• 3.3.2 序列注释及蛋白编码框的识别73-76
• 3.3.3 功能基因注释与分类76-79
• 3.3.4 高表达量Unigenes的功能基因注释分析79-80
• 3.3.5 转录组中抗冷相关Unigene表达分析80-82
• 3.3.6 基于转录组的SSR分子标记分析82-86
• 3.4 讨论86-90
• 3.5 测序数据处理与提交NCBI90-91
• 第4章 低温锻炼提高小桐子抗冷性过程中数字基因表达谱的解析91-114
• 4.1 研究目标与内容91
• 4.2 实验材料与方法91-94
• 4.2.1 实验材料91
• 4.2.2 实验方法91-94
• 4.2.2.1 数字基因表达谱测序样品的制备及测序91-93
• 4.2.2.2 基于转录组测序数据的数字基因表达谱Tag的功能注释93
• 4.2.2.3 差异表达基因的GO功能聚类及分析93
• 4.2.2.4 小桐子抗冷相关功能基因的差异表达分析与鉴定93-94
• 4.3 结果与分析94-108
• 4.3.1 数字基因表达谱Tag处理与统计94-98
• 4.3.2 小桐子低温锻炼条件下差异表达基因的鉴定98-102
• 4.3.3 小桐子低温锻炼条件下差异表达基因的GO功能聚类分析102-103
• 4.3.4 小桐子抗冷相关代谢或信号转导途径差异表达基因的鉴定103-107
• 4.3.4.1 基于淀粉降解代谢的可溶性糖积累途径差异表达基因的鉴定103-105
• 4.3.4.2 非ABA依赖的冷信号转导途径差异表达基因的鉴定105-107
• 4.3.5 小桐子低温锻炼条件下新表达基因的鉴定107-108
• 4.4 讨论108-114
• 第5章 低温锻炼中小桐子关键功能基因的时空表达分析114-133
• 5.1 研究的目标与内容114
• 5.2 实验材料与方法114-118
• 5.2.1 实验材料114
• 5.2.2 实验方法114-118
• 5.2.2.1 总RNA的提取、纯化和定量检测114
• 5.2.2.2 cDNA第一链的合成114
• 5.2.2.3 引物设计114-117
• 5.2.2.4 引物测试117
• 5.2.2.5 RT-PCR检测117-118
• 5.2.2.6 基因表达模式的聚类分析118
• 5.3 结果与分析118-128
• 5.3.1 总RNA的提取及质量分析118-120
• 5.3.2 小桐子抗冷相关基因在不同器官中的表达特性120
• 5.3.3 冷锻炼条件下抗冷相关基因的RT-PCR分析120-126
• 5.3.4 抗冷相关基因的表达模式聚类分析126-128
• 5.4 讨论128-133
• 第6章 GS3与nsLTPA基因的克隆及酵母功能验证133-154
• 6.1 研究的内容与目标133
• 6.2 材料与方法133-135
• 6.2.1 实验材料133
• 6.2.2 实验方法133-135
• 6.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测133
• 6.2.2.2 cDNA第一链的合成133
• 6.2.2.3 Jc GS3与JcnsLTPA基因全长cDNA的克隆133-134
• 6.2.2.4 酵母表达载体的构建、转化134-135
• 6.2.2.5 重组酵母菌抗冷性功能验证135
• 6.3 结果与分析135-149
• 6.3.1 JcGS3与JcnsLTPA基因全长cDNA的克隆135-137
• 6.3.2 GS3与nsLTPA的生物信息学分析137-146
• 6.3.2.1 Jc GS3与JcnsLTPA基因信息及结构137-140
• 6.3.2.2 JcGS3与JcnsLTPA氨基酸序列功能元件鉴定140-143
• 6.3.2.3 JcGS3与JcnsLTPA的进化分析143-145
• 6.3.2.4 JcGS3与JcnsLTPA高级结构鉴定及分析145-146
• 6.3.3 酵母表达载体构建与转化及抗冷性评价146-149
• 6.3.3.1 酵母表达载体构建及转化146-148
• 6.3.3.2 转基因酵母的抗冷性评价148-149
• 6.4 讨论149-154
• 6.4.1 JcGS3基因149-151
• 6.4.2 JcnsLTPA基因151-154
• 第7章 CHS与GA20ox基因的克隆及酵母功能验证154-173
• 7.1 研究的内容与目标154
• 7.2 材料与方法154-156
• 7.2.1 实验材料154
• 7.2.2 实验方法154-156
• 7.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测154
• 7.2.2.2 cDNA第一链的合成154
• 7.2.2.3 Jc CHS与JcGA20ox基因全长cDNA的克隆154-155
• 7.2.2.4 Jc CHS酵母表达载体的构建、转化155
• 7.2.2.5 Jc CHS重组酵母菌抗冷性功能验证155-156
• 7.3 结果与分析156-169
• 7.3.1 JcCHS与JcGA20ox基因全长c DNA的克隆156-157
• 7.3.2 JcCHS与JcGA20ox的生物信息学分析157-167
• 7.3.2.1 Jc CHS与JcGA20ox基因的初步分析157-159
• 7.3.2.2 JcCHS与Jc GA20ox氨基酸序列功能元件鉴定159-164
• 7.3.2.3 JcCHS与Jc GA20ox系统进化分析164-166
• 7.3.2.4 JcCHS与Jc GA20ox的高级结构鉴定及分析166-167
• 7.3.3 JcCHS酵母表达载体构建、转化及抗冷性评价167-169
• 7.3.3.1 Jc CHS酵母表达载体构建及转化167-168
• 7.3.3.2 Jc CHS重组酵母的抗冷性评价168-169
• 7.4 讨论169-173
• 7.4.1 JcCHS基因169-171
• 7.4.2 JcGA20ox基因171-173
• 第8章 PDI与MSRA基因的克隆及酵母功能验证173-194
• 8.1 研究的内容与目标173
• 8.2 材料与方法173-175
• 8.2.1 实验材料173
• 8.2.2 实验方法173-175
• 8.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测173
• 8.2.2.2 cDNA第一链的合成173
• 8.2.2.3 Jc PDI与Jc MSRA基因全长cDNA的克隆173-174
• 8.2.2.4 Jc PDI酵母表达载体的构建、转化174
• 8.2.2.5 Jc PDI重组酵母菌抗冷性功能验证174-175
• 8.3 结果与分析175-189
• 8.3.1 JcPDI与JcMSRA基因全长c DNA的克隆175-176
• 8.3.2 JcPDI与JcMSRA的生物信息学分析176-187
• 8.3.2.1 JcPDI与Jc MSRA的初步分析176-180
• 8.3.2.2 JcPDI与Jc MSRA氨基酸序列功能元件鉴定180-183
• 8.3.2.3 JcPDI与Jc MSRA系统进化分析183-185
• 8.3.2.4 JcPDI与Jc MSRA高级结构鉴定及分析185-187
• 8.3.3 JcPDI酵母表达载体构建、转化及抗冷性评价187-189
• 8.3.3.1 Jc PDI酵母表达载体构建及转化187-188
• 8.3.3.2 Jc PDI重组酵母的抗冷性评价188-189
• 8.4 讨论189-194
• 8.4.1 JcPDI基因189-191
• 8.4.2 JcMSR基因191-194
• 第9章 CBF1与CBF2基因的克隆及表达载体的构建194-206
• 9.1 研究的内容与目标194
• 9.2 材料与方法194-195
• 9.2.1 实验材料194
• 9.2.2 实验方法194-195
• 9.2.2.1 RNA的提取、纯化及定量检测194
• 9.2.2.2 cDNA第一链的合成194
• 9.2.2.3 Jc CBF1与JcCBF2基因全长cDNA的克隆194-195
• 9.2.2.4 Jc CBF1与JcCBF2酵母菌表达载体的构建195
• 9.3 结果与分析195-204
• 9.3.1 JcCBF1与JcCBF2基因全长cDNA的克隆195-196
• 9.3.2 JcCBF1与JcCBF2的生物信息学分析196-202
• 9.3.2.1 Jc CBF1与JcCBF2的初步分析196-198
• 9.3.2.2 JcCBF1与JcCBF2功能元件及结构域鉴定198-202
• 9.3.3 JcCBF1与JcCBF2酵母菌表达载体的构建202-204
• 9.4 讨论204-206
• 第10章 研究结论与展望206-211
• 10.1 研究结论206-210
• 10.2 研究展望210-211
• 参考文献211-229
• 致谢229-230
• 课题资助及论文发表情况230-231

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 王晓敏;刘凡值;张可元;龙英;龙飞;王定川;;2011年初贵州麻疯树冻害调查与分析[J];广东农业科学;2011年22期

2 罗通;邓骛远;陈放;;不同产地麻疯树的抗冷性研究[J];内蒙古大学学报(自然科学版);2006年04期

  本文关键词：基于RNA-Seq解析小桐子抗冷性形成的分子机制及其关键基因的克隆与功能分析，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：352895